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文檔簡介
1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目模式生物,在理論研究和生產(chǎn)應用方面都具有重要作用。家蠶基因組框架圖、精細圖和全基因組表達芯片等研究工作的完成,為家蠶基因的鑒定與功能研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。家蠶血細胞在家蠶代謝、先天免疫以及發(fā)育變態(tài)等方面扮演重要角色。盡管眾多有關(guān)家蠶血細胞的相關(guān)基因已經(jīng)被初步克隆與鑒定,但如何研究和應用這些基因仍然是亟待解決的問題。家蠶轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵理論及技術(shù)體系的構(gòu)建,迫切需要家蠶血細胞特異表達啟動子作為研究工具,來實
2、現(xiàn)對家蠶血細胞的深入研究。對家蠶血細胞特異啟動子的探索有助于血細胞相關(guān)基因功能的解析以及造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究,為家蠶血細胞研究體系奠定重要的理論基礎(chǔ)。
本研究利用家蠶組織芯片表達數(shù)據(jù)以及qRT-PCR方法篩選出三個血細胞特異表達基因;并基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫分別對三個候選基因的啟動子區(qū)域進行克隆;使用重組桿狀病毒(rAcMNPV)為基因轉(zhuǎn)移載體并結(jié)合流式細胞分析技術(shù),分析候選基因啟動子活性并對其蠶體組織特異性進行了驗證。主要研
3、究結(jié)果如下:
1.家蠶血細胞特異表達基因的篩選
基于家蠶組織芯片數(shù)據(jù),通過qRT-PCR進行組織表達分析,最終篩選得到家蠶血細胞特異高表達的3個候選基因,分別為BmCathepsinO、Bmintegrinβ2、Bm04862。BmCathpsinO屬于半胱氨酸蛋白酶家族,主要參與溶酶體的水解作用;Bmintegrinβ2是家蠶整合素β家族成員之一,參與細胞表面粘附,并在家蠶細胞中發(fā)揮免疫功能;而Bm04862是一個
4、未曾報道的新基因。
2.BmCathepsinO啟動子的克隆及活性分析
基于家蠶基因組數(shù)據(jù),克隆了BmCathepsinO基因5端約2000bp的側(cè)翼區(qū)啟動子pBmCatO2K,利用重組桿狀病毒(rAcMNPV)作為基因轉(zhuǎn)移載體,證明克隆的啟動子序列在蠶體具有血細胞特異性活性。隨后,選擇5個不同大小的啟動子片段pBmCatO1.5K、pBmCatO1K、 pBmCatO0.5K、 pBmCatO0.2K在蠶體進行啟動
5、子活性分析,結(jié)果表明,該啟動子核心區(qū)域位于-80至+76bp,而一段254bp(-333~-80bp)的片段存在組織特異性調(diào)控元件,控制該基因在血細胞中的特異表達。
3.Bmintegrinβ2基因啟動子克隆以及蠶體活性分析
從Bmintegrinβ2基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游分別選取了2,3和5Kb啟動子片段進行了克隆。發(fā)現(xiàn)pBmIntβ22K、 pBmIntβ23K、 pBmIntβ25K在細胞水平以及蠶體均不能驅(qū)動紅
6、色熒光蛋白表達,表明這3個啟動子無活性。隨后選取兩個跨第一內(nèi)含子的啟動子pBmIntβ23KIN和pBmIntβ21.5KIN進行克隆,兩啟動子片段在病毒介導下在蠶血細胞有一定的啟動子活性,在脂肪體和絲腺中無活性。結(jié)果表明啟動子存在于第一內(nèi)含子內(nèi)或該區(qū)域存在增強元件,調(diào)控該基因的血細胞特異性。
4.Bm04862基因鑒定及其啟動子研究
應用RACE技術(shù)獲得Bm04862全長cDNA序列,并對其進行生物信息學分析。Bm
7、04862基因開放閱讀框819bp,共編碼273個氨基酸殘基,預測其為跨膜蛋白;對Bm04862蛋白亞細胞定位表明其聚集在細胞核膜和部分細胞質(zhì)中。qRT-PCR結(jié)果表明發(fā)該基因在家蠶血細胞感染外源大腸桿菌24h后表達量顯著上調(diào),推測該基因參與家蠶免疫防御。對其啟動子區(qū)域進行克隆得到2194bp片段,病毒介導發(fā)現(xiàn)在BmE-SWU3細胞、蠶體血細胞,脂肪體以及絲腺體均能驅(qū)動DsRed表達,細胞水平流式分析其啟動子活性為Pph啟動子的4.8倍
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