山羊DCT基因啟動子活性區(qū)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件探究.pdf

1、山羊DCT基因是調(diào)控山羊毛色的候選基因之一，目前市場上現(xiàn)有的彩色羊毛（絨）制品均是由化工染料染色而成，這不僅污染了自然環(huán)境，而且對人類身體健康會造成嚴重危害。若能通過對毛色基因的研究人為的控制動物毛色的改變，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
　　本試驗通過對山羊DCT基因5'側(cè)翼區(qū)序列及第一外顯子區(qū)序列特征進行分析，發(fā)現(xiàn)了多個啟動子調(diào)控元件，包括TATA box，GC box，M box，CAAT box，CpG島和32 bp元

2、件。下載人和小鼠DCT基因啟動子序列，與山羊DCT基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)-648～+73 bp與人DCT基因啟動子相似度較高(81％)，-472～-28bp與小鼠DCT基因啟動子相似度較高(78％)。根據(jù)以上生物信息學分析，結(jié)合在線啟動子預測結(jié)果，利用普通分子克隆的方法構(gòu)建了5個5'端缺失序列的啟動子預測區(qū)報告基因載體，以瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染A375細胞，雙熒光素酶檢測試劑檢測啟動子活性。結(jié)果顯示，片段P3（-990～+232 bp）的活

3、性最高，初步將核心啟動子區(qū)定位在這一區(qū)域。以P3片段序列為模板，采用閃電克隆的方法構(gòu)建了6個3'端缺失序列的報告基因載體，瞬時轉(zhuǎn)染A375細胞，檢測啟動子活性。結(jié)果顯示，片段P8(-881～-154bp)的啟動子活性最高，且極顯著高于片段P3(P＜0.01)，因此可確定，-881～-154 bp區(qū)域為山羊DCT基因的核心啟動子區(qū)。
　　以片段P8為模板，構(gòu)建SOX10、MITF和OTX2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變的6個報告基因載體，結(jié)

4、果SOX10結(jié)合位點突變的載體啟動子活性極顯著降低(P＜0.01)，MITF和OTX2結(jié)合位點突變的載體啟動子活性極顯著增強(P＜0.01)。表明轉(zhuǎn)錄因子SOX10對山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄起到正調(diào)控作用，轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對山羊DCT基因調(diào)控作用尚需深入研究。
　　利用亞硫酸氫鹽測序的方法檢測了黑色和白色山羊-184 bp～+14 bp和+386bp～+665bp位置CpG島的甲基化水平，共發(fā)現(xiàn)了32個甲基化位點，-184 b

5、p～+14 bp區(qū)域兩種毛色山羊平均甲基化水平差異不顯著（P＞0.05），+386 bp～+665 bp區(qū)域白色山羊平均甲基化水平極顯著高于黑色山羊(P＜0.01)。其中，+476 bp、+516bp和+564 bp位置白色山羊甲基化水平顯著高于黑色山羊(0.01＜P＜0.05)，+553bp和+568bp位置白色山羊甲基化水平極顯著高于黑色山羊（P＜0.01）。結(jié)果表明，+386bp～+665 bp區(qū)域DNA甲基化可能造成白色山羊DC

6、T基因的低表達。
　　對唐山奶山羊、濟寧青山羊、南江黃羊快長系和南江黃羊黑色系4個山羊品種各20個個體的DCT基因核心啟動子區(qū)進行PCR測序，發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，分別位于-640 bp、-550 bp、-543 bp和-517bp。其中，-640 bp位點TT基因型，-543 bp位點TT基因型，-517 bp位點GG基因型可能與山羊深色被毛形成有關;-640bp位點GG基因型，543 bp位點CC基因型，-517bp位點AA基因

7、型與白色被毛形成有關;-550bp位點CC基因型可能與山羊青色被毛形成有關。
　　綜上，-881～-154 bp區(qū)域為山羊DCT基因的核心啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄因子SOX10對其轉(zhuǎn)錄起到正調(diào)控作用，白色山羊+386 bp～+665bp區(qū)域DNA的高甲基化可能造成白色山羊DCT基因的低表達。DCT基因上游-640 bp、-550bp、-543bp和-517 bp位點的4個SNP在不同毛色山羊中的基因型分布差異與毛色特征的關系需進一步深入研究