腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控SEA基因抗肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 本研究首先以紅色熒光蛋白為目的基因，比較肝癌來源的hTERT啟動(dòng)子、肺癌來源的hTERT啟動(dòng)子以及Survivin啟動(dòng)子腫瘤特異性啟動(dòng)子在肺癌A549中的啟動(dòng)活性；選擇在A549肺癌細(xì)胞中有較強(qiáng)啟動(dòng)活性的Survivin啟動(dòng)子為調(diào)控序列，構(gòu)建pGL-S-SEA真核表達(dá)質(zhì)粒；通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的特異性表達(dá)；通過PBMC刺激實(shí)驗(yàn)以MTT法檢測重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物的超抗原活性；表達(dá)產(chǎn)物活

2、化的PBMC的抗A549細(xì)胞活性的研究。本研究旨在為探索肺癌及其它腫瘤的靶向基因治療途徑及機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用PCR法和基因克隆技術(shù)在真核表達(dá)質(zhì)粒pGL3-hTERT、基礎(chǔ)上分別構(gòu)建3種啟動(dòng)子調(diào)控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED。 2.將該3種重組質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞(A549)和人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)，72h后在

3、熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)，并用Imagepro-Plus6.0分析3種啟動(dòng)子在相同時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)紅色熒光蛋白的表達(dá)水平。 3.以ATCC25923金黃色葡萄球菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增sea基因。選擇在A549肺癌細(xì)胞中有較強(qiáng)啟動(dòng)活性的Survivin啟動(dòng)子為調(diào)控序列，以pGL-S-RED為基礎(chǔ)，由sea基因替代其“Red”基因，構(gòu)建pGL-S-SEA真核表達(dá)質(zhì)粒；用脂質(zhì)體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，72h后提取總RNA，通

4、過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的特異性表達(dá)。 4.用脂質(zhì)體將pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液。制備健康獻(xiàn)血者PBMC，用上清液和細(xì)胞裂解液進(jìn)行PBMC刺激實(shí)驗(yàn)，并用MTT法、通過比較刺激指數(shù)以檢測其促細(xì)胞增殖效應(yīng)。 5.制備經(jīng)細(xì)胞裂解液、上清液誘導(dǎo)24h后的PBMC，分別將其與A549細(xì)胞共同培養(yǎng)，24h后，用MTT法、通過比較其殺傷率以檢測測其殺瘤效應(yīng)。

5、 結(jié)果： 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實(shí)pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞72h后，在A549細(xì)胞中觀察到了紅色熒光蛋白的表達(dá)，而在MRC-5細(xì)胞中無紅色熒光表達(dá)。經(jīng)Imagepro-Plus6.0分析，pGL-S-RED熒光蛋白在A549細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)，pGL-LH-RED次之，pGL-H-RED最弱，在A549細(xì)胞中的

6、熒光強(qiáng)度(IOD)分別為201.17、171.70和136.34。 2.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實(shí)pGL-S-SEA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細(xì)胞后，RT-PCR.結(jié)果表明，pGL-S-SEA質(zhì)粒在A549細(xì)胞中成功表達(dá)sea目的基因，基強(qiáng)度為內(nèi)參(GADPH gene)的65.96％。 3.經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細(xì)胞的裂解液具有促進(jìn)人PBMC增殖活性、上清液無明顯促

7、PBMC增殖作用，裂解液實(shí)驗(yàn)組、上清液實(shí)驗(yàn)組和PHA陽性對(duì)照組的刺激指數(shù)分別為1.29、0.95和1.58。 4.經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)的PBMC，表現(xiàn)出一定的殺傷A549細(xì)胞的活性，其中裂解液實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殺傷活性分別為31.965％和21.116％。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了3種腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，3種啟動(dòng)子均表現(xiàn)出