土鱉蟲含藥血清對(duì)激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨分化差異蛋白組學(xué)的影響.pdf

1、目的:
　　 探討土鱉蟲干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成脂和成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制,檢驗(yàn)抑制成脂分化和促進(jìn)成骨分化的靶位蛋白或相關(guān)蛋白,為中藥土鱉蟲治療激素所致的股骨頭缺血性壞死提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.選用優(yōu)質(zhì)中藥土鱉蟲,采用十天法制備土鱉蟲含藥血清。
　　 2.取4周齡清潔級(jí)SD大鼠脛骨和股骨骨髓進(jìn)行BMSCs貼壁培養(yǎng)和傳代,檢測(cè)傳三代BMSCs表面抗原CD45、CD90的表達(dá)陽性

2、率以鑒定,用油紅“O”染色對(duì)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 3.傳三代BMSCs分為空白對(duì)照組、激素組和土鱉蟲組。激素組:應(yīng)用大劑量激素誘導(dǎo)使其向脂肪細(xì)胞分化,土鱉蟲組:激素誘導(dǎo)的同時(shí)給予土鱉蟲含藥血清干預(yù)。
　　 4.各組干預(yù)6天后對(duì)成骨和成脂標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)檢測(cè)。
　　 5.利用光鏡和電鏡觀察三組BMSCs細(xì)胞的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　 6.運(yùn)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技

3、術(shù)(iTHA,Q)標(biāo)記三組樣本的蛋白,二維液相色譜質(zhì)譜儀(2DLC-MS/MS)鑒定蛋白并進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.根據(jù)表面抗原CD45和CD90的陽性率,鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs;根據(jù)油紅“O”染色,鑒定激素誘導(dǎo)BMSCs成脂肪細(xì)胞。
　　 2.甘油三酯檢測(cè)結(jié)果:激素組較空白對(duì)照組明顯升高(P＜0.05),土鱉蟲組較激素組明顯下降(P＜0.01)。
　　 3.堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果:激素

4、組較空白對(duì)照組明顯下降(P＜0.05),土鱉蟲組較激素組明顯升高,(P＜0.01)。
　　 4.透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)結(jié)果:空白對(duì)照組大鼠BMSCs細(xì)胞表面有較豐富的微絨毛樣突起。細(xì)胞質(zhì)可見較多細(xì)胞器,可見少量脂肪滴。激素組的BMSCs細(xì)胞表面無微絨毛樣突起。細(xì)胞內(nèi)可見大量脂肪滴,少量細(xì)胞器。部分細(xì)胞核溶解,破裂。土鱉蟲組的BMSCs細(xì)胞表面有少量的微絨毛樣突起。細(xì)胞器數(shù)量一般,未見脂肪滴。
　　 5.通過質(zhì)譜鑒定共成功檢

5、測(cè)出了三組樣本近520種蛋白質(zhì),其中217種蛋白質(zhì)有定量信息。以激素組為對(duì)照,在空白對(duì)照組中共有15種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著的表達(dá)上調(diào),12種出現(xiàn)下調(diào)蛋白:在土鱉蟲組中共有16種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著的表達(dá)上調(diào),14種出現(xiàn)顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.土鱉蟲含藥血清可以抑制BMSCs成脂分化,促使BMSCs成骨分化。
　　 2.通過質(zhì)譜鑒定三組共成功檢測(cè)出了520種蛋白質(zhì),其中217種蛋白質(zhì)有定量信息。
　　 3.