Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝免疫耐受中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝的免疫耐受狀態(tài)與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),它不僅可以在免疫性肝炎中發(fā)揮作用,也可以決定感染性肝臟疾病的免疫應(yīng)答程度。如嚴(yán)重危害生命健康的乙肝、丙肝,由于機(jī)體免疫系統(tǒng)對病毒及其抗原反應(yīng)低下或特異性耐受,患者臨床表現(xiàn)為持續(xù)病毒感染狀態(tài),肝臟長期存在慢性炎癥與肝細(xì)胞增殖性改變,最終發(fā)展為肝硬化、肝癌,若將耐受狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為應(yīng)答狀態(tài)則可有效清除肝炎病毒,改善疾病癥狀;另一方面,肝免疫耐受的成功誘導(dǎo)能延長移植肝的存活,是提高生存質(zhì)量的重要手段。

2、近年來,在對自身免疫性肝炎發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),機(jī)體在易感性基因的作用下,受環(huán)境因子、藥物或感染因子的誘導(dǎo),導(dǎo)致肝自身免疫耐受狀態(tài)削弱,產(chǎn)生針對肝細(xì)胞膜自身靶抗原的細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng),造成自身免疫性肝損傷。如何抑制自身免疫應(yīng)答,維持免疫耐受狀態(tài),是目前的研究熱點(diǎn)。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞因其在維持機(jī)體自身免疫耐受狀態(tài)中的關(guān)鍵作用而日益受到重視,根據(jù)來源及功能不同,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可分為多個(gè)亞群,包括CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T

3、r1(Tr1 regulatory T cell,Tr1 cell)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th3等,它們的功能異常是自身免疫性疾病如類風(fēng)關(guān)、自身免疫性肝損傷等的重要的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制,其中Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1細(xì)胞)在自身免疫性疾病中的抑制作用備受關(guān)注。Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以高分泌IL-10為主要特征,具有低增殖性,主要通過其分泌的IL-10抑制初始和記憶性Th1和Th2的反應(yīng)。另外,在外源IL-10的刺激下初始CD4+T細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為Tr1

4、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。已有研究證明Tr1細(xì)胞在口服和系統(tǒng)性全身免疫耐受中均發(fā)揮重要作用,但Tr1細(xì)胞在肝免疫耐受中的作用及其機(jī)制研究甚少?；诖?為了闡明Tr1細(xì)胞在肝臟免疫耐受中的作用,我們建立了ConA誘導(dǎo)的小鼠肝免疫耐受模型,探討Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在其中的作用及其機(jī)制,以期為自身免疫性肝炎的治療和維持肝移植的免疫耐受提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 第一部分 ConA誘導(dǎo)的小鼠肝免疫耐受模型的建立
　　 我們以亞致死劑量ConA

5、預(yù)處理、致死劑量ConA再次攻擊小鼠建立肝免疫耐受模型。第0天,以亞致死劑量ConA預(yù)處理Balb/c小鼠,生理鹽水預(yù)處理組作為對照,第8天分別給予兩組小鼠致死劑量ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷,再次ConA給予8小時(shí)后檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肝病理損傷的變化。從血清學(xué)指標(biāo)來看,ConA預(yù)處理組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較生理鹽水預(yù)處理組小鼠顯著降低;小鼠肝組織病理檢查結(jié)果顯示,ConA預(yù)處理組僅有極少的炎性細(xì)胞浸潤,生理鹽水預(yù)處理組顯

6、示大量浸潤的炎性細(xì)胞在肝組織擴(kuò)散并導(dǎo)致局部肝細(xì)胞壞死。因此通過以上結(jié)果證明我們成功誘導(dǎo)了肝免疫耐受,建立了ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型。
　　 第二部分 Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中的作用
　　 在成功建立ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型的基礎(chǔ)上,我們聚焦在T淋巴細(xì)胞,觀察脾臟中T淋巴細(xì)胞數(shù)量和比例的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比較,ConA預(yù)處理組的CD4+T和CD8+T細(xì)胞絕對數(shù)目明顯增加,EUSA和

7、流式檢測的結(jié)果均提示CD4+T細(xì)胞具有Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型(IL-10+,IL-4-,IFN-γ-,Foxp3-);同時(shí),胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測發(fā)現(xiàn)Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝臟和脾臟中的比例明顯升高,且細(xì)胞表面高表達(dá)CD69和CD44分子,呈現(xiàn)活化表型,提示處于效應(yīng)狀態(tài)。為了解Tr1細(xì)胞亞群在抵御ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用,我們將ConA預(yù)處理組的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸正常小鼠,發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)輸具有。Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型的ConA預(yù)處理組的C

8、D4+T細(xì)胞的小鼠,可以抵御致死劑量ConA的攻擊:更進(jìn)一步,我們以體外誘導(dǎo)的Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸正常小鼠,以致死劑量ConA誘導(dǎo)急性肝損傷,同樣發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能顯著抵御致死劑量ConA的攻擊,保護(hù)肝臟免受損傷。這些結(jié)果充分提示ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型通過誘導(dǎo)Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),介導(dǎo)肝免疫耐受。
　　 第三部分 Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中的作用機(jī)制
　　 為驗(yàn)

9、證Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),我們以IL-10阻斷抗體體內(nèi)作用,發(fā)現(xiàn)可以顯著逆轉(zhuǎn)Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)效應(yīng),表明Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是通過抑制性細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的。進(jìn)一步,為探討DCs在誘導(dǎo)Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的作用,我們檢測了ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中DCs的成熟度和其分泌的細(xì)胞因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中DCs表現(xiàn)不成熟表型,并分泌較高量的I

10、L-10,這一結(jié)果提示在肝免疫耐受模型中DCs不成熟和分泌較高量的IL-10可能參與了Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。因此,我們進(jìn)一步分選了肝免疫耐受模型中CD11c+DC細(xì)胞和naive CD4+細(xì)胞共培養(yǎng),觀察其是否可誘導(dǎo)。Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝免疫耐受模型中的CDllc+DC細(xì)胞可以有效誘導(dǎo)Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生;加入IL-10阻斷抗體,可以逆轉(zhuǎn)此作用。以上結(jié)果表明Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要通過IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,并且Co

11、nA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中分泌IL-10的未成熟DCs參與了肝免疫耐受模型中Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生,這可能是ConA誘導(dǎo)的肝免疫耐受模型中Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加并發(fā)揮效應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制。通過上述研究,我們得到以下的結(jié)論:1.成功建立ConA誘導(dǎo)的小鼠肝免疫耐受模型,明確了肝免疫耐受模型誘導(dǎo)了Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,且呈活化表型。2.Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抵御ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷,并通過其分泌細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮抑制作用。3.