IDO在真菌性角膜炎真菌免疫耐受中的作用及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討吲哚胺2，3雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）在真菌性角膜炎中的表達(dá)、介導(dǎo)真菌性角膜炎真菌免疫耐受的功能以及相關(guān)的模式識(shí)別受體對(duì)其調(diào)控的機(jī)制。
　　方法：分別在真菌性角膜炎患者、體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞真菌感染的細(xì)胞模型以及真菌性角膜炎小鼠動(dòng)物模型上研究了IDO的表達(dá)規(guī)律、IDO介導(dǎo)真菌性角膜炎中真菌免疫耐受的功能及相關(guān)的模式識(shí)別受體對(duì)IDO及下游炎癥因子的調(diào)控機(jī)制。據(jù)此，實(shí)驗(yàn)從三個(gè)

2、方面加以證實(shí)：⑴選擇2012年1月至2014年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者31例（31眼）為真菌感染組，根據(jù)角膜潰瘍的嚴(yán)重程度及裂隙燈下的炎癥評(píng)分分為輕、中、重度感染三組，收集角膜病灶周圍的角膜上皮組織；同時(shí)收集角膜移植中健康供體制作角膜植片后剩余的周邊角膜緣組織6例（6眼）為正常對(duì)照組，刮取植片的角膜上皮組織。免疫熒光法檢測(cè)臨床真菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達(dá)與定位，qRT-PCR法檢測(cè)正常對(duì)照組和真菌

3、性角膜感染組中IDO的表達(dá)差異及其與真菌性角膜炎感染嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染模型，免疫組織化學(xué)染色、qRT-PCR法、Western blot法進(jìn)一步明確真菌性角膜炎角膜組織中IDO的表達(dá)規(guī)律。⑵體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞，加入煙曲霉菌孢子刺激液，qRT-PCR檢測(cè)不同作用濃度及時(shí)間點(diǎn)角膜上皮細(xì)胞中IDO的表達(dá)，篩選作用顯著的刺激液；qRT-PCR及ELISA檢測(cè)1-MT（IDO特異性的抑制劑）預(yù)處理

4、后煙曲霉菌刺激液誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞IDO表達(dá)的改變以及對(duì)IDO下游炎癥因子分泌的影響。將健康的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（給予PBS飲水預(yù)處理，刮取直徑約2mm的中央角膜上皮，覆蓋角膜接觸鏡）、煙曲霉菌感染組（刮取直徑約2mm的中央角膜上皮后接種真菌，覆蓋角膜接觸鏡）和1-MT預(yù)處理+煙曲霉菌感染組（IDO的抑制劑1-MT飲水預(yù)處理后，刮取中央角膜上皮后接種真菌，再覆蓋角膜接觸鏡），根據(jù)感染的嚴(yán)重程度進(jìn)行炎癥評(píng)分，收集小鼠的角膜行

5、qRT-PCR、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)，比較IDO阻斷前后角膜的感染嚴(yán)重程度的評(píng)分，檢測(cè)IDO的表達(dá)、定位及其對(duì)IDO下游的炎癥因子表達(dá)的影響，觀察IDO阻斷前后角膜、淋巴結(jié)及脾臟組織中Th17和Treg細(xì)胞含量之間的變化，從而分析IDO介導(dǎo)真菌免疫耐受的相關(guān)機(jī)制。⑶體外培養(yǎng)人的角膜上皮細(xì)胞，給予不同的模式識(shí)別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體，qRT-PCR篩選角膜上皮細(xì)胞中調(diào)控IDO表達(dá)的模式識(shí)別受體；分別給予1-M

6、T，Dectin-1的激動(dòng)和抑制劑預(yù)處理，在煙曲霉菌孢子誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的IDO誘導(dǎo)模型上，應(yīng)用qRT-PCR、ELISA和Western blot檢測(cè)Dectin-1對(duì)IDO及其下游炎癥因子的調(diào)控。
　　結(jié)果：①對(duì)臨床真菌性角膜炎患者的病變角膜組織行免疫熒光染色在蛋白水平證實(shí)IDO在正常的角膜上皮組織中無(wú)或極少量的表達(dá)，而在煙曲霉菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達(dá)明顯增加并主要表達(dá)于角膜上皮組織中；在臨床真菌性角膜炎患者的

7、角膜上皮組織中，qRT-PCR檢測(cè)顯示：與正常對(duì)照組相比，真菌性角膜炎患者的角膜上皮組織中的IDO mRNA表達(dá)明顯增加，并且隨著感染及炎癥程度的增加，IDO的表達(dá)升高越明顯，輕、中、重度各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染的模型中 qRT-PCR結(jié)果顯示真菌感染后 IDO mRNA表達(dá)明顯增高，1d達(dá)到高峰，之后開始降低。Western blot結(jié)果顯示IDO的蛋白水平在真菌感染后1d開始增加，

8、3d達(dá)高峰。②在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞中，滅活的煙曲霉菌孢子可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中IDO的表達(dá)量增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴的變化趨勢(shì)。qRT-PCR結(jié)果顯示：與煙曲霉菌孢子刺激組相比，1-MT預(yù)處理組角膜上皮細(xì)胞中IDO及下游通路因子IL-1β、IL-6表達(dá)增加，ELISA檢測(cè)在蛋白水平證實(shí)了相關(guān)的炎癥因子的變化；在C57BL/6小鼠和1-MT預(yù)處理鼠的煙曲霉菌感染模型中，疾病評(píng)分顯示1-MT預(yù)處理模型鼠組的感染程度明顯重于單純的煙曲霉菌感染

9、組，qRT-PCR、ELISA顯示：與AF組相比，AF+1-MT組鼠角膜中IDO及IDO下游通路因子IL-1β、IL-6表達(dá)明顯增加。qRT-PCR結(jié)果顯示Th17型細(xì)胞因子（IL-17、IL-23）表達(dá)增加，Treg型細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）表達(dá)減少。流式細(xì)胞術(shù)的檢查結(jié)果顯示，與 AF組相比，IDO阻斷后小鼠真菌感染動(dòng)物模型中角膜及脾臟組織中Th17細(xì)胞含量增加，Treg細(xì)胞含量減少，Th17/Treg細(xì)胞含量比增加，差異具

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③采用不同的模式識(shí)別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體即Curdlan、Pam3csk4、LPS作用于角膜上皮細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)顯示TLR2、TLR4的特異性配體不能誘導(dǎo)IDO的表達(dá)，而真菌感染組和Dectin-1特異性的配體Curdlan組均能明顯地誘導(dǎo)IDO的表達(dá)。給予Dectin-1的激動(dòng)劑和抑制劑能夠調(diào)控?zé)熐咕鷮?duì)IDO的刺激作用，Western blot檢測(cè)在蛋白水平證實(shí)了這一變化。