阻斷雙信號傳導途徑調(diào)節(jié)同種異體T細胞的活性介導免疫耐受.pdf

1、目的： 異基因造血干細胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)是目前根治白血病、骨髓增殖異常綜合癥、淋巴瘤等惡性血液系統(tǒng)疾病和重型再生障礙性貧血，以及某些遺傳性疾病、免疫缺陷病、自身免疫性疾病的最有效方法之一。排斥、移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)與感染是其主要合并癥，三者中尤以后二者最為突出。因為感染常

2、在GVHD和治療GVHD所繼發(fā)的免疫功能低下的基礎(chǔ)上發(fā)生，所以，實際上因供受者主要或次要組織相容性抗原(majororminorhistocompatibilityantigen，MHC/mHC)存在差異而引起的GVHD是allo-HSCT最主要的合并癥，亦是影響移植成敗的關(guān)鍵問題。 本研究旨在探討一條降低GVHD而又保留GVL效應(yīng)的移植新途徑，為誘導allo-HSCT的免疫耐受提供新的方法。 本研究以單相混合淋巴細胞反應(yīng)(mi

3、xedlymphocytereaction，MLR)為反應(yīng)體系，體外模擬allo-HSCT，在同種異體正常反應(yīng)T細胞存在下，體外聯(lián)合應(yīng)用TJU103和CTLA4-Ig分別阻斷同種異體反應(yīng)性T細胞活化的抗原識別信號和共刺激分子信號途徑，通過檢測供者T細胞的增殖和細胞毒活性、免疫和克隆表型以及分泌細胞因子的濃度探討：①二者聯(lián)合應(yīng)用能否誘導對以接觸的抗原產(chǎn)生耐受；②如果能誘導免疫耐受，其可能的機制；③是否影響對白血病細胞的殺傷效應(yīng)。

4、實驗方法： 第一部分：人T細胞克隆分析技術(shù)和TCR基因重排方法的建立 1.設(shè)計并合成人TCRαβT細胞26個TCRBV(TCRβchainvariablegene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCRBC(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物(帶FAM標記)：設(shè)計并合成人34個TCRAV(TCRαchainvariablegene，TCRAV)家族的上游引物和共用的TCRAC(TCRαch

5、ainconstantgene，TCRAC)的下游引物(內(nèi)側(cè)端引物帶FAM標記)；在人TCRBC基因中合成實驗對照的TCRBC1、TCRBC2上游引物。分別以T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat和Burkitt淋巴瘤細胞株Raji作為陽性和陰性對照，以正常健康人外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)和正常分娩的臍血單個核細胞(cordbloodmononuclearcell，CBMC)為

6、研究樣本，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增并用1.5％瓊脂糖凝膠檢測24個TCRBV基因家族和32個TCR基因家族包含完整CDR3區(qū)段的cDNA，采用6％測序膠基因掃描分析單克隆水平Jurkat細胞和群體多克隆水平正常人PBMC中TCRαβT細胞α和β鏈的CDR3基因譜系多態(tài)性和長度分布，建立穩(wěn)定地監(jiān)測TCRαβT細胞克隆分析技術(shù)。 2.根據(jù)TCR基因有效重排時參與因素的復雜性，選取TCR基因剪切和連接(非同源末端重組

7、系統(tǒng)，non-homologousend-oiningmachinery，NHEJ)的主要調(diào)控蛋白：重組酶激活基因酶(RecombinationActivatingGene，RAG)、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeonucieotidyltransferase，TdT)、Ku70和Ku80連接蛋白為研究對象，設(shè)計合成各蛋白基因上下游引物。以胸腺組織，Jurkat細胞和正常人的PBMC為研究對象(可分別作為本研究的陽性、陰性

8、對照。參照文獻和本校分子免疫學研究所的研究，Jurkat細胞的重排體系是開放的，可與胸腺一起作為陽性對照)，提取各樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測其mRNA的表達，并對產(chǎn)物進行鑒定。 第二部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-g誘導供者T細胞的免疫耐受 常規(guī)分離正常人PBMC12份，等分成6份，分別作為供者和受者，以供者

9、的PBMC作為反應(yīng)細胞，MMC處理分成的PBMC作為受者刺激細胞，體外建立模擬allo-HSCT供、受者間的單相混合淋巴細胞反應(yīng)MLR體系，分成TJU103組、CTLA4-Ig組、聯(lián)合組，分別加入25mg/L的TJU103、15mg/L的CTLA4-Ig、等濃度的TJU103和CTLA4-Ig，設(shè)單純對照組，進行5天標準的單相MLR。分別應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(memylthiazolyltetrazolium，MTT)還原法和LDH釋放法

10、檢測供者淋巴細胞的增殖活性以及不同效靶比時供者淋巴細胞對受者PBMC和KG1a細胞的細胞毒活性。 第三部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig體外誘導供者T細胞免疫耐受的機制 用流式細胞儀檢測單相MLR后供者淋巴細胞中CD4+T、CD25+T、CD40L+T、CD8+T細胞的百分率，用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-labeledimmunosorbentassay，ELISA)檢測T細胞分泌的細胞因子：轉(zhuǎn)化生長因子(tms

11、forminggrowthfactorβ1，TGF-β1)、干擾素γ(interferonγ，INF-γ)和白細胞介素-4(interleukin，IL-4)的濃度，應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細胞克隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達情況，以探討其誘導免疫耐受的機制。 第四部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig應(yīng)用對T細胞細胞毒效應(yīng)的影響 第一章 腫瘤細胞誘導同種異體外周血T細胞克隆增殖 常規(guī)

12、分離正常人PBMC6份，將人急性髓系白血病細胞KG1a和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251經(jīng)絲裂霉素C(mitomycin，MMC)處理(MMC處理組)或反復凍融制備成細胞溶解物Lysate(Lysate組)后，進行混合淋巴/月中瘤細胞培養(yǎng)(mixturelymphocyte/tumorcellcluture，MLTC)。應(yīng)用流式細胞技術(shù)、MTT還原法和乳酸脫氫酶(LDH)4小時釋放法分別檢測誘導后增殖T細胞免疫表型、增殖活性和對腫瘤細胞的殺傷活

13、性；分別應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細胞克隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達情況。 第二章 TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig應(yīng)用對T細胞細胞毒效應(yīng)的影響 取上述單相MLR后的供者PBMC作為反應(yīng)細胞，加入KG1a細胞Lysate進行5天MLTC。應(yīng)用MTT還原法、流式細胞技術(shù)和LDH釋放法分別檢測供者T細胞的增殖活性、免疫表型和對KG1a細胞的細胞毒活性，同時應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細胞克

14、隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達情況。 第五部分：單倍型造血干細胞移植前后T細胞克隆變化的初步研究 選取2例進行hap-HSCT的白血病患者，以供者、移植前后受者的PBMC為研究樣本，監(jiān)測TCRAV和TCRBV家族克隆表達的動態(tài)變化，CDR3克隆性質(zhì)及測定各家族的利用率，觀察其與受者免疫功能重建和GVHD的關(guān)系。同時檢測供者NK細胞的KIR分型和受者的HLA基因型，觀察其與移植后患者生存狀況的關(guān)系。

15、 統(tǒng)計學方法： 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差(x±s)表示，以析因設(shè)計資料方差分析比較各組間的殺傷率和T細胞增殖抑制率的差異，以LSD與SNK法進行組間比較。以單因素方差分析比較細胞因子濃度、T細胞增殖率、CD4+CD25+T細胞和CD40L+T細胞的百分率的差異，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。以P<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1.基因掃描分析人TCRαβT細

16、胞CDR3基因型是一種簡便、可靠、靈敏度高的T細胞克隆檢測技術(shù)，可用于腫瘤、造血干細胞移植、自身免疫性疾病等的T細胞應(yīng)答機制方面的研究。 2.RT-PCR檢測NHEJ中的幾種主要調(diào)控蛋白RAG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdTmRNA表達的方法穩(wěn)定、可靠，可作為研究TCR異常重排機制的技術(shù)平臺。 3.TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig通過降低供者T淋巴細胞對受者正常組織抗原的增殖能力和細胞毒活性誘導移植免疫耐受，其不

17、影響供者淋巴細胞的抗白血病效應(yīng)。其誘導免疫耐受的機制可能與上調(diào)Th2細胞比率，阻斷CD4+和CD8+T淋巴細胞之間的協(xié)同效應(yīng)，誘導出免疫耐受的T細胞克隆有關(guān)。 4.腫瘤細胞和腫瘤細胞溶解物均可在體外誘導出同種異體特異性CTL，該CTL細胞可能為優(yōu)勢表達的對腫瘤應(yīng)答的TCRAV和TCRBV家族克隆T細胞。TJU103聯(lián)合CTLSA-Ig不影響供者淋巴細胞的抗白血病效應(yīng)。 5.T細胞克隆分析技術(shù)可以用于動態(tài)監(jiān)測allo-HS

18、CT后受者的免疫功能；還可以用于尋找介導GVHD和特殊感染的T細胞克隆。此外，供者KIR基因型和受者HIA基因型錯配可以用于擇優(yōu)選擇合適的供者。 本研究的創(chuàng)新點： 1.在抗原存在的條件下，首次通過同時調(diào)節(jié)同種異體反應(yīng)性T細胞活化的HLA/p-CD4和B7-CD28/CTLA4信號傳遞途徑誘導免疫耐受，并且不影響T細胞對白血病細胞的細胞毒活性。 2.首次從T細胞克隆和TCR二次重排角度認識T細胞的免疫耐受和二次反應(yīng)