T-,Reg-細(xì)胞在異基因造血干細(xì)胞移植中誘導(dǎo)免疫耐受作用的研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是當(dāng)今治療惡性和難治性造血系統(tǒng)疾病的最有效手段之一，移植物抗宿主病(GVHD)是影響allo-HSCT療效的關(guān)鍵。因此，如何降低GVHD的發(fā)病率是當(dāng)今移植免疫的熱點(diǎn)課題。 CD4+CD25+調(diào)控T細(xì)胞(regulatoryTcell，TReg)來源于胸腺，是一群表型和功能特異的T細(xì)胞，在體內(nèi)能誘導(dǎo)免疫耐受。研究表明，TReg細(xì)胞分泌的TGF-β與自身的細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活后再借助細(xì)胞間接

2、觸發(fā)揮抑制效應(yīng)。激活的TReg細(xì)胞能夠與高濃度的TGF-β特異性抗體結(jié)合，從而阻斷TReg細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)。另外TReg細(xì)胞能夠抑制CD3特異性抗原活化的CD4+CD25-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖并抑制其分泌細(xì)胞因子。TReg細(xì)胞也可通過細(xì)胞間接接觸抑制。競(jìng)爭(zhēng)性抑制是TReg細(xì)胞發(fā)揮活性作用的另一途徑。因而TReg細(xì)胞是在機(jī)體維持免疫自穩(wěn)過程中起重要作用的獨(dú)立細(xì)胞群。 目的： 本研究通過動(dòng)物模型將純化的供體TReg

3、細(xì)胞作為接受異基因骨髓(allo-BMT)移植小鼠的干預(yù)因素，觀察移植前輸注供體TReg細(xì)胞對(duì)allo-BMT后GVHD發(fā)生的影響。并在臨床上觀察移植前輸注不同數(shù)量供者TReg細(xì)胞的allo-HSCT患者GVHD發(fā)生情況，且進(jìn)一步探討供者TReg細(xì)胞數(shù)對(duì)移植后造血和免疫重建的影響。據(jù)此來評(píng)價(jià)TReg細(xì)胞在allo-HSCT過程中的應(yīng)用潛能。 方法： 1.建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo-BMT模型，體外磁珠分

4、離純化供鼠外周血CD4+CD25+TReg細(xì)胞，將受鼠隨機(jī)分為三組，在移植骨髓后6～8小時(shí)分別予尾靜脈輸注CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞和RPMI-1640培養(yǎng)液。以血常規(guī)、體重、生存期和肝、脾、小腸病理組織變化為觀察指標(biāo)并進(jìn)行組間比較。 2.對(duì)接受allo-HSCT患者采用流式細(xì)胞儀(FACS)測(cè)定移植物中TReg細(xì)胞值和移植后患者不同時(shí)間點(diǎn)外周血T淋巴細(xì)胞亞群及TReg細(xì)胞。按輸注供者TReg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)是

5、否大于或等于10.0×106/kg為標(biāo)準(zhǔn)分為高TReg細(xì)胞輸注組和低TReg細(xì)胞輸注組，比較兩組患者移植后造血與免疫重建、TReg細(xì)胞重建、GVHD發(fā)生及總體生存率有無差異。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)或百分率(％)表示，率比較采用卡方檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，2個(gè)以上樣本均數(shù)多重比較采用方差分析(F檢驗(yàn))或重復(fù)測(cè)量，相關(guān)分析用直線相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存模型和Lo

6、grank檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1.在動(dòng)物模型中TReg陽性細(xì)胞移植組與TReg陰性細(xì)胞移植組、空白對(duì)照組均獲造血重建，TReg陽性細(xì)胞移植組白細(xì)胞(WBC)及血小板(BPC)的重建時(shí)間均快于TReg陰性細(xì)胞移植組及空白對(duì)照組，三組WBC＞1.0×109/L的時(shí)間分別為8.14±3.26天、17.62±5.71天、19.81±6.77天，BPC＞20.0×109/L的時(shí)間分別為5.29±1.34天、8.97±3.44天、9.5

7、2±3.92天。三組小鼠平均存活時(shí)間分別為41.45±17.88天、18.75±14.39天、25.67±16.84天，TReg陽性細(xì)胞移植組亦較另外兩組顯著延長(zhǎng)(P值分別為0.041、0.003)。肝、脾、小腸組織病理標(biāo)本顯示三組小鼠移植后均出現(xiàn)不同程度的GVHD病理改變，TReg陽性細(xì)胞移植組中存活30天或接近30天瀕死小鼠的GVHD相關(guān)病理損害較接近30天瀕死的另外兩組小鼠有一定程度的減輕。 2.27例接受allo-HSC

8、T的患者中，高TReg細(xì)胞組和低TReg細(xì)胞組患者aGVHD發(fā)生率分別為16.67％(2/12)和66.67％(10/15)，二組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理存在顯著性差異(P=0.019)。并且移植供者TReg細(xì)胞數(shù)與aGVHD的發(fā)生程度直線相關(guān)分析呈負(fù)相關(guān)(r=-0.396，P=0.041)。兩組移植后造血重建時(shí)間和cGVHD的發(fā)生無顯著性差異。 3.接受allo-HSCT的兩組患者中，高TReg細(xì)胞組患者移植后+30天CD3+細(xì)胞、CD4

9、+CD3+細(xì)胞重建(72.69±7.81％、27.63±11.85％)明顯快于低TReg細(xì)胞組患者(61.62±11.11％、18.19±5.92％)，二組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理存在顯著性差異(P值分別為0.014，0.020)。 4.TReg細(xì)胞作為一種免疫調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞，臨床上比較其對(duì)allo-HSCT后患者的疾病復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響，高TReg與低TReg細(xì)胞組復(fù)發(fā)率分別為16.67％和0.00％(P=0.188)，總生存率分別是45.0

10、0±32.20％和83.90±10.40％(P=0.958)，無病生存率為40.90±29.50％和83.90±10.40％(P=0.621)。 討論： 影響allo-HSCT療效的主要因素是GVHD，如何降低allo-HSCT中的GVHD是提高療效的關(guān)鍵。TReg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞近年在移植免疫領(lǐng)域引起極大重視。本研究利用異基因小鼠動(dòng)物模型，將TReg細(xì)胞作為預(yù)處理的一部分，在移植干細(xì)胞后6～8小時(shí)輸注供體TRe

11、g細(xì)胞證實(shí)：TReg細(xì)胞能降低allo-BMT小鼠的aGVHD和促進(jìn)造血重建。同時(shí)分析27例接受allo-HSCT的患者，按移植物中TReg細(xì)胞數(shù)分為高TReg和低TReg細(xì)胞輸注組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：移植物中TReg細(xì)胞數(shù)與aGVHD的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，TReg細(xì)胞可降低移植患者的aGVHD，但對(duì)造血重建、cGVHD及移植后長(zhǎng)生存無明顯影響。分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床病例觀察在造血重建上的不同，可能與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中TReg細(xì)胞是“有或無”的干預(yù)因

12、素而臨床觀察病例僅是TReg細(xì)胞量的不同有關(guān)。對(duì)移植后TReg細(xì)胞是否參與移植物抗白血病(GVL)作用尚需進(jìn)一步研究。 結(jié)論： 1.在小鼠allo-BMT模型中，供體TReg細(xì)胞作為預(yù)處理方案的組成部分，有助于allo-BMT后造血系統(tǒng)的重建，降低移植后GVHD發(fā)生率，延長(zhǎng)移植小鼠存活時(shí)間。 2.臨床接受高供者TReg細(xì)胞輸注的allo-HSCT患者，有利于提升移植后CD4+CD25+TReg細(xì)胞重建，降低aGV