基于Gateway技術(shù)建立的慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞是來源于早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)或桑椹胚的一種多潛能細(xì)胞[1]，能在體外自我更新，并且可以在適合的條件下分化為胚胎或成體的各種類型的組織細(xì)胞[2]，也可以和宿主囊胚進(jìn)行嵌合，因而成為當(dāng)前生物工程研究的熱點(diǎn)，在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和1臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮著日益重要的作用[3，4]。由于在倫理、道德等多方面存在爭議，人類胚胎干細(xì)胞的相關(guān)研究受到諸多限制[5，6]。而非人靈長類

2、由于在進(jìn)化地位上與人類的近親關(guān)系而成為基礎(chǔ)研究與臨床醫(yī)用的不可替代的橋梁。非人靈長類胚胎干細(xì)胞與人胚胎干細(xì)胞具有非常相似的生物學(xué)特性。食蟹猴為靈長目猴科，可作為人類發(fā)育的體外模型。此外，食蟹猴胚胎干細(xì)胞可為人類胚胎干細(xì)胞的研究及應(yīng)用人胚胎干細(xì)胞治療一系列疾病提供經(jīng)驗(yàn)。 將外源基因通過一定載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在干細(xì)胞的研究中起著越來越重要的作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使干細(xì)胞攜帶有標(biāo)記基因，可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3、中作為示蹤劑，對移植的細(xì)胞進(jìn)行跟蹤；體外實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)記基因便于干細(xì)胞的觀察，特別是與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，可以清楚的觀察干細(xì)胞的變化。 鑒于上述食蟹猴胚胎干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要作用，因此如何能將外源基因高效地轉(zhuǎn)入食蟹猴胚胎干細(xì)胞并能在不影響其生物學(xué)特性的情況下持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)就顯得十分必要。目前，轉(zhuǎn)基因的方法有很多種[7]，但靈長類胚胎干細(xì)胞由于呈克隆狀生長，生長環(huán)境比較復(fù)雜，培養(yǎng)條件比較苛刻，很難轉(zhuǎn)染外源基因而得到較純的克隆，較

4、理想的轉(zhuǎn)染方法多是通過慢病毒載體介導(dǎo)而完成的。慢病毒載體中含有目的基因的載體質(zhì)粒需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自行構(gòu)建，傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)需要酶切、連接等過程，操作過程繁瑣復(fù)雜，并且有假陽性的出現(xiàn)，明顯阻礙了實(shí)驗(yàn)的快速進(jìn)行。因此，近年來興起了一種更為靈活通用的克隆方法-Gateway技術(shù)，Gateway技術(shù)是利用九噬菌體特異性結(jié)合位點(diǎn)可在Clonase的作用下整合到宿主E．coli的基因組中的一種新的通用型克隆技術(shù)。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建載體，只

5、需要在目的基因兩端加上特異性的15bp大小的att結(jié)合位點(diǎn)，通過兩種Clonase作用下的BP和LR結(jié)合反應(yīng)，即可將目的基因?qū)胼d體中，其整合率可達(dá)到100％。而且去除了酶切、連接過程，可以避免假陽性的出現(xiàn)。因其操作方便,Gateway技術(shù)近年來在基因工程中的應(yīng)用已越來越廣泛。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)的主要研究思路是利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puto/EF1-α-dTomato和2K7puto/EF1—α-hrGFP兩種載體質(zhì)粒，通過病毒

6、包裝產(chǎn)生慢病毒，然后利用獲得的慢病毒轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細(xì)胞，通過對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行純化，得到完全表達(dá)dTomato和hrGFP的陽性克隆，并簡單研究這兩種轉(zhuǎn)染后的食蟹猴胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此，本研究分為以下兩個部分內(nèi)容： 第一部分：利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體。 第二部分：2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7p

7、uro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體 1.1 目的: 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種載體質(zhì)粒，通過病毒包裝技術(shù)產(chǎn)生相應(yīng)慢病毒，高速離心后對病毒進(jìn)行濃縮，測定病毒滴度，并評

8、價病毒的生物安全性，目的在于通過操作簡便的Gateway技術(shù)和病毒包裝技術(shù)構(gòu)建安全、高效的慢病毒載體。 1.2 方法： 1.2.1利用Gateway技術(shù)中涉及到的LR結(jié)合反應(yīng)，將入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行連接，構(gòu)建2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒。

9、 1.2.2分別將2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒與ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集及濃縮病毒。 1.2.3采用梯度稀釋法對病毒滴度進(jìn)行測定。 1.2.4用病毒原液感染293FT細(xì)胞，收集含病毒的條件培養(yǎng)液，再次感染新的293FT細(xì)胞，觀察新感染的293FT細(xì)胞有無熒光表達(dá)，評價病毒的生物安全

10、性。 1.3 結(jié)果： 1.3.1 入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP 和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行LR結(jié)合反應(yīng)后，得到2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，得到單細(xì)菌克隆。 1.3.2將2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α—

11、hrGFP載體質(zhì)粒與ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細(xì)胞48h至72h后，熒光顯微鏡下可觀察到強(qiáng)紅色熒光和綠色熒光并有細(xì)胞融合現(xiàn)象，收集病毒上清液高速離心后，可見病毒顆粒沉淀在離心管底部。 1.3.3梯度稀釋法測定本實(shí)驗(yàn)包裝產(chǎn)生的兩種慢病毒2K7puro/EF1-α-dTomatoTto和2K7puro/EF1-α-hrGFP滴度分別為：5.4×107TU/ml和17.6×1

12、07TU/ml。 1.3.4收集感染過上述病毒的293FT細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，再次感染新的293FT細(xì)胞后，未見新感染的293FT細(xì)胞有熒光表達(dá)，證明上述病毒具有自身滅活作用。 1.4 結(jié)論： 1.4.1成功構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和D2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒。 1.4.2利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)

13、粒成功包裝產(chǎn)生兩種慢病毒。 1.4.3兩種慢病毒滴度分別為：5.4×107TU/ml和7.6×107TU/ml。 1.4.4病毒生物安全性評價結(jié)果表明病毒感染細(xì)胞后無復(fù)制能力，培養(yǎng)液中無病毒顆粒釋放。 第二部分2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染食蟹猴胚胎干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 2.1目的： 將2K7pruo/EF1-α-dTomato和2K7

14、puro/EE1-α-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染cmES，使其分別表達(dá)dTomato和qhrGFP，純化轉(zhuǎn)染后的cmES，通過免疫熒光染色鑒定純化后的cmES，并通過體外分化實(shí)驗(yàn)證明純化后的cmES具有多向分化潛能。目的在于通過慢病毒轉(zhuǎn)染這種高效率的轉(zhuǎn)基因方法，得到保持cmES生物學(xué)特性的分別表達(dá)dTomato和hrGFP的純陽性cmES克隆(dTomato-cmES和hrGFP-cmES)。 2.2方法： 2.2.1

15、分別利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)染dTomato和hrGFP進(jìn))kcmES，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。 2.2.2利用胰酶消化和連續(xù)機(jī)械法傳代兩種方法純化轉(zhuǎn)染后的cmES。 2.2.3 dTomato-cmES和hrGFP—cmES生物學(xué)特性的分析：對dTomato-cmES和hrGFP-cmES的分子標(biāo)記及體外分化能力進(jìn)行檢測。 2.

16、3結(jié)果： 2.3.1慢病毒轉(zhuǎn)染48h后，熒光倒置顯微鏡下可見部分cmES克隆表達(dá)紅色熒光或綠色熒光，克隆均為部分表達(dá)熒光，未見純的陽性克隆。轉(zhuǎn)染后的cmES克隆狀態(tài)與轉(zhuǎn)染前無明顯區(qū)別，克隆生長情況良好，僅見極少量的死細(xì)胞。 2.3.2胰酶消化轉(zhuǎn)染后的cmES克隆成單細(xì)胞或連續(xù)5次以上機(jī)械法傳代后，可得到完全表達(dá)dTomato和hrGFP的陽性cmES克隆。 2.3.3 dTomato—cmES和hrGFP—cmE

17、S生物學(xué)特性：dTomato-cmES和hrGFP-cmES表達(dá)OCT-4、SSEA-4和TRA-1-60，而不表達(dá)SSEA-1和SSEA-3。dTomato—cmES和hrGFP-cmES自然分化形成的胚體中含有三胚層的細(xì)胞。 2.4結(jié)論： 2.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)染cmES，轉(zhuǎn)染后的cmES部分表達(dá)dTomato或hrGFP，細(xì)胞生長基本不受病毒轉(zhuǎn)染的影響。 2.4.2成功獲得完全表達(dá)dTomato和hrG