人類胚胎干細胞與小鼠孤雌胚胎干細胞系的建立與鑒定.pdf

1、胚胎干細胞具有自我更新及多向分化潛能，為胚胎發(fā)育學、遺傳學、人類疾病的發(fā)病機理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。由于不同來源的hES細胞株HLA等遺傳背景不一樣，其應用價值也不同，因此需要建立更多的hES細胞株來滿足臨床與基礎等研究的需要。人類胚胎來源有限，獲得更多hES細胞系的根本途徑是改善培養(yǎng)體系，提高建系率。孤雌胚胎干細胞的研究可以避免倫理的限制，并且在細胞移植時不存在免疫排斥反應，能夠保證治療的有效性，成為近期研究的熱點。本實

2、驗首先探討影響hES細胞建系的因素，建立一套穩(wěn)定高效的hES分離培養(yǎng)體系，并建立廢棄胚胎來源的hES細胞系；進一步激活小鼠卵母細胞，建立小鼠孤雌胚胎干細胞系，為人類孤雌胚胎干細胞及核移植胚胎干細胞建系研究奠定基礎。 第一部分人類胚胎干細胞建系方法的改良與廢棄胚胎來源的人胚胎干細胞系的建立與鑒定 第一章 hES細胞建系方法的改良及hES細胞系的建立 [研究目的]對hES細胞分離培養(yǎng)體系進行改良，建立廢胚來源的hES

3、細胞系。 [材料方法] 1．收集IVF/ICSI治療周期第三天的低質量胚胎，體外培養(yǎng)至：D5,D6天時，將早期囊胚轉入含有hLIF及bFGF細胞因子的G2.3培養(yǎng)液內繼續(xù)培養(yǎng)1～2天，觀察囊胚ICM變化。 2．采用機械法與免疫外科法分離ICM，對比兩種方法獲得的原代克隆質量及建系情況。 3．在hES培養(yǎng)液內添加不同濃度的FBS及SR，比較其對hES建系的影響。 4．采用機械法、膠原酶Ⅳ消化及胰酶消

4、化進行hES的傳代，比較三者對hES細胞擴增效率的影響。 [結論] 1．在G2.3培養(yǎng)液內添加hLIF以及bFGF進行囊胚優(yōu)化培養(yǎng)，可改善囊胚質量，使ICM明顯增殖。 2．在hES培養(yǎng)液內同時添加SR以及少量的FBS，可以促進ICM的增殖，減少其分化，提高hES細胞的建系率。 3．構建了穩(wěn)定高效的hES細胞分離培養(yǎng)體系，為人類孤雌胚胎干細胞及核移植胚胎干細胞建系研究奠定基礎。 4．建立了4株廢胚來

5、源的hES細胞系，為發(fā)育生物學及遺傳學等研究提供新的實驗模型。 第二章人類胚胎干細胞系的生物學特性鑒定 [研究目的]對所建立hES細胞系進行干細胞生物學特性鑒定，了解其應用價值。 [材料方法] 1．對hES細胞的生長情況進行觀察，計算其群體倍增時間。 2．所有的hES細胞體外培養(yǎng)至15代后，低密度傳代至四孔板，進行AKP以及ES表面抗原SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81

6、染色鑒定。 3．Trizol法提取各株hES細胞的RNA，進行RT-PCR反應檢測Oct-4轉錄因子的表達情況。 4．hES細胞體外培養(yǎng)至10代后，開始進行染色體核型鑒定，每隔10代檢測一次，每次計數(shù)20個分裂像。 5．體內外分化能力檢測：懸浮培養(yǎng)hES細胞，觀察擬胚體的形成，并對自發(fā)分化的細胞進行特異性抗原檢測；將hES細胞團快接種到SCID小鼠的腹股溝皮下，觀察是否有腫瘤生長。 6．提取各株hES細胞

7、的DNA，對其16個STR位點進行鑒別。 [結論] 1．4株hES細胞系在體外長期傳代中，能夠維持ES細胞的生物學特性，證明構建的培養(yǎng)體系能夠維持hES細胞的自我更新能力。 2．STR位點分析用于hES細胞系的鑒定，可以為其提供相應的“身份證”，區(qū)分不同的細胞株。 3．廢胚來源的hES細胞系，可能存在一些染色體遺傳方面的缺陷，必須進行核型分析。 4．本實驗建立了1株13三體平衡易位核型的hES細胞

8、系，該細胞系為遺傳病的發(fā)病機制研究提供豐富的細胞來源。 第三章三原核胚胎來源的 hES 細胞系的建立與鑒定 [研究目的]觀察三原核胚胎的發(fā)育潛能，建立三倍體hES細胞系，并對其生物學特性進行鑒定。 [方法] 1．收集IVF/ICSI治療周期中受精后第一天的三原核胚胎，在G1.3,G2.3培養(yǎng)液內序慣培養(yǎng)，觀察三原核胚胎的發(fā)育潛能。 2．免疫外科法分離囊胚ICM,采用含有15％SR及5％FBS的培養(yǎng)

9、液進行培養(yǎng)10天內首次傳代，以后每4～5天傳代一次。 3．對獲得的ES細胞系進行生物學特性鑒定，包括AKP染色，表面抗原染色，Oct-4轉錄因子檢測，核型鑒定，個體識別及分化能力檢測。 [結論] 1．三原核胚胎體外發(fā)育潛能差，大多停滯于6～8細胞期，只有極少數(shù)能夠發(fā)育到囊胚。 2．從三原核胚胎來源的囊胚可用于建立hES細胞系，建立的三倍體細胞系和正常二倍體細胞系一樣能夠自我更新及多向分化。 3．三

10、倍體hES細胞系的建立為探討多原核胚胎形成的原因，及多倍體胚胎的發(fā)育機制等研究提供新的實驗模型. 第二部分小鼠孤雌胚胎干細胞系的建立與鑒定 [研究目的]探討小鼠卵母細胞孤雌激活的最適方法，建立小鼠孤雌ES的分離培養(yǎng)體系，并對其生物學特性及印記基因表達等進行鑒定。 [方法] 1．采用SrCI<,2>聯(lián)合CB，以及Ionomycin聯(lián)合6-DMAP對(C57BL/6 x DBA/2)B6D2F1雜交小鼠的卵母

11、細胞進行激活，胚胎在體外培養(yǎng)4天觀察其發(fā)育潛能，評估兩種方法的激活效果。 2．將獲得的囊胚與桑椹胚分別接種于飼養(yǎng)層細胞上，觀察孤雌胚胎原代ICM的生長情況，比較建系率。 3．對建立的小鼠孤雌ES細胞系進行AKP活性、表面標志物、染色體核型及體內外分化能力的鑒定。 4．微衛(wèi)星位點分析小鼠孤雌ES細胞系的基因型，并對其印記基因的表達進行檢測。 [結論] 1．采用SrCI<,2>聯(lián)合CB，Ionomyc

12、in聯(lián)合6-DMAP均能激活小鼠卵母細胞， SrCI<,2>聯(lián)合CB激活效果好。 2．本實驗成功建立了12株小鼠的孤雌ES細胞系，和受精胚胎來源的mES細胞系一樣具有自我更新及分化全能性。 3．本研究首次由桑葚胚建立了小鼠孤雌ES細胞，該方法的成功為建立ES細胞系提供新的胚胎來源。 4．孤雌ES細胞的基因型為單倍體，在其傳代早期可以表達父本及母本來源的印記基因。 5．孤雌ES細胞系的建立為腫瘤學、表觀遺傳