食蟹猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯?pdf

1、間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群非均質(zhì)的多能非造血干細(xì)胞。在體外培養(yǎng)時呈現(xiàn)貼壁生長的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，并且具有多向分化的潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及其他間充質(zhì)組織細(xì)胞等。骨髓是間質(zhì)干細(xì)胞的最重要來源。近年來，MSC也在許多組織中得以成功獲取，其中包括臍帶血、胎盤、羊膜、滑液膜以及脂肪組織等。 MSCs的一些令人關(guān)注的特性在于：1、局部麻醉狀

2、態(tài)下的直接骨髓穿刺可以方便地獲得MSCs；2、MSCs在體外易于大量擴增，在擴增的同時可以保持其多向分化潛能不丟失；3、MSCs可以通過病毒或非病毒載體的方法來進行基因修飾；4、MSCs可以在體內(nèi)向病損組織“歸巢”，并且通過分化為相關(guān)組織的細(xì)胞或其他分子機制來對病損組織進行修復(fù)。 因此，到目前為止，已有許多運用MSCs治療人類疾病的動物模型被建立，包括骨或軟骨缺損、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心臟損傷、造血系統(tǒng)疾病以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等等。

3、不僅如此，使用MSCs作為基因?qū)牍ぞ咭灾委熌承┘膊∫呀?jīng)成為關(guān)注的焦點，因此，MSCs已經(jīng)被認(rèn)為是一類很有實用價值的細(xì)胞治療工具。 盡管如此，在人體臨床試驗被正式允許前，MSC輸注的安全性考慮以及細(xì)胞在體內(nèi)的分布等等均應(yīng)當(dāng)在高等哺乳動物中被充分的評價，例如非人靈長類動物等。早前有研究描述了恒河猴Msc的生物特性與人類MSC的相似，他們認(rèn)為，恒河猴可以作為一類測試MSCs在體內(nèi)的輸注、分化能力、安全性、毒性以及效率的合適模型。因為

4、目前食蟹猴已經(jīng)在日本和歐洲等的已經(jīng)像恒河猴一樣廣泛用于各類醫(yī)學(xué)實驗，因此，食蟹猴的MSC(cMSCs)將可能對人MSC用于臨床前的研究產(chǎn)生重要的應(yīng)用價值。到目前為止，國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于cMSCs的分離培養(yǎng)以及相關(guān)生物學(xué)特征的研究報道。因此，本研究的目的在于從成年食蟹猴的骨髓中分離出cMSCs，并且對其生物學(xué)特性和多向分化潛能進行鑒定。然后采用幾種轉(zhuǎn)染方法，比較轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因到cMSCs中的效率，并嘗試得到穩(wěn)定表達GFP

5、的cMSCs，為今后體內(nèi)移植的cMSCs示蹤打下良好的基礎(chǔ)。 本研究包括以下三個章節(jié)： 1、分離培養(yǎng)cMSCs，并對其生物學(xué)特性與多向分化性進行鑒定。 2、用不同的轉(zhuǎn)染方法將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)染入cMSCs，比較不同轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率高低。 3、用具有最高轉(zhuǎn)染率的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染cMSCs后，進行傳代擴增培養(yǎng)，檢測標(biāo)記基因是否持續(xù)穩(wěn)定表達，并對轉(zhuǎn)染后的cMSCs進行多向分化性鑒定。 目的：

6、 本實驗?zāi)康脑谟趶某赡晔承泛锕撬柚蟹蛛xcMSCs并鑒定他們的生物學(xué)特性和分化潛能。然后選取幾種常用的轉(zhuǎn)染方法將GFP基因轉(zhuǎn)入食蟹猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并對各自的轉(zhuǎn)染率進行比較，以得到一種高效、可行的轉(zhuǎn)染方法，而這種方法轉(zhuǎn)染后可以得到穩(wěn)定表達目的基因的cMSCs，且同時保持cMSCs的生物學(xué)特性。 方法： 1、用密度梯度離心方法分離骨髓標(biāo)本，用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)、擴增得到cMSCs，并對其多向分化潛能進行鑒定。

7、2、選取幾種轉(zhuǎn)染方法(1ipofeetmine2000<'TM>，Nucleofector<'TM>和Lentiviral載體)將GFP基因轉(zhuǎn)入第3代的cMSCs，24小時后，流式細(xì)胞儀檢測各種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率。 3、選取幾種轉(zhuǎn)染方法中具有最高轉(zhuǎn)染率的方法轉(zhuǎn)染GFP到cMSCs，連續(xù)傳代培養(yǎng)，熒光顯微鏡檢測GFP是否穩(wěn)定表達；對轉(zhuǎn)入GFP的cMSCs進行成骨成脂鑒定，檢測是否仍具有多向分化潛能。 結(jié)果： 1、cM

8、SCs的分離培養(yǎng)與鑒定Ficoll-Hypaque分離液得到的單個核細(xì)胞24小時后有貼壁細(xì)胞，3天后可見梭形細(xì)胞。原代培養(yǎng)約9-10天可達80﹪融合。胰酶消化傳代后，可在含抗病毒藥物Tenofovir10nM的低糖DMEM完全培養(yǎng)液中傳代擴增。cMSCs表達間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)記，如CD29，CD73，CD105，CD166，不表達造血細(xì)胞的表面標(biāo)記，如CD34，CD45。cMSCs在體外多代傳代后依然保持正常核型。 cMSCs在體

9、外具備誘導(dǎo)成骨、成脂肪和成軟骨能力。成脂誘導(dǎo)2周后，進行油紅O染色，可見呈橙紅色的脂滴。成骨誘導(dǎo)3周后，用茜素紅進行染色，可見呈桔紅色的鈣結(jié)節(jié)。成軟骨誘導(dǎo)3周后，誘導(dǎo)的細(xì)胞團塊切片可以經(jīng)過Ⅱ型膠原免疫熒光方法驗證軟骨細(xì)胞分泌的特異性基質(zhì)。 2、cMSCs轉(zhuǎn)染方法的比較與篩選轉(zhuǎn)染24小時后，流式細(xì)胞儀檢測各種方法的轉(zhuǎn)染率。其中Lipofeetamine轉(zhuǎn)染試劑盒的轉(zhuǎn)染率為2﹪，核轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染率為14.3﹪，慢病毒的轉(zhuǎn)染率為44.6﹪

10、。因此，在幾種方法中，慢病毒轉(zhuǎn)染具有最高的轉(zhuǎn)染率。 3、慢病毒轉(zhuǎn)染cMSCs外源基因表達和多向分化潛能將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞連續(xù)傳代，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光并未消減。 油紅O染色轉(zhuǎn)染后定向向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的cMSCs發(fā)現(xiàn)橙紅色的脂滴；用茜素紅染色轉(zhuǎn)染后向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的cMSCs發(fā)現(xiàn)桔紅色的鈣結(jié)節(jié)。 結(jié)論： 1、首次成功從成年雄性食蟹猴股骨骨髓中分離出MSC，并對其進行體外培養(yǎng)、傳代擴增，同時進行了包括克隆形成能力、

11、核型和表面標(biāo)記在內(nèi)的生物學(xué)特性分析。驗證了抗病毒藥物Tenofovir在cMSCs體外培養(yǎng)中的重要作用。 2、得到的食蟹猴骨髓問質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)向成骨、成脂和成軟骨分化。 3、選擇GFP為目的基因，運用3種轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染cMSCs，比較了3種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率，其中慢病毒載體的轉(zhuǎn)染率最高，達44﹪以上，其次是核轉(zhuǎn)染。 4、慢病毒載體介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染食蟹猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后，GFP可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達