在人胚胎干細胞中建立EBV載體系統(tǒng)及其初步應(yīng)用.pdf

1、中南大學(xué)碩士學(xué)位論文在人胚胎干細胞中建立EBV載體系統(tǒng)及其初步應(yīng)用姓名：趙明申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：姚開泰20050501僅包含4個低親和力的EBNA1結(jié)合位點，為DNA復(fù)制起始區(qū)。在細胞核內(nèi)表達的EBNA1蛋白通過識別or于能夠有效地增加從胞漿轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)的oriP質(zhì)粒量、增強oriP附近啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，并能防止含有oriP的質(zhì)粒在細胞分裂中丟失。EBV載體避免了傳統(tǒng)病毒載體可能產(chǎn)生的實驗風(fēng)險，如基因插入失

2、活、突變等。本實驗利用EBV基因組的兩個組分EBNA1和oriP，在hES細胞中建立了EBV載體系統(tǒng)。實驗結(jié)果表明，它能夠顯著提高11ES細胞的轉(zhuǎn)基因效率。實驗的主要內(nèi)容包括：首先在飼養(yǎng)層上建立hES細胞的培養(yǎng)體系。準備鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)，制各適合人ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。將hES細胞接種于飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，傳代擴增、凍存。其次建立hES細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。參考Xu等的實驗方法，

3、接種hES細胞到預(yù)鋪細胞外基質(zhì)(Matrigel)的六孔板上，加入MEFs預(yù)處理的條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系可使IlES細胞長期保持未分化狀態(tài)，并且不會改變hES細胞原有的生物學(xué)特性，其凍存與復(fù)蘇的效果與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法無差別。因此，該培養(yǎng)體系可用于培養(yǎng)hIES細胞，并為hEs細胞轉(zhuǎn)基因研究及大規(guī)模培養(yǎng)奠定了良好的基礎(chǔ)。再次，由于不同啟動子調(diào)控下的綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)染hIES細胞后，報告基因的表達存在明顯的差異，因此需要比較并選

4、擇在人ES細胞中具有較高調(diào)節(jié)活性的啟動子。我們利用增強型綠色熒光蛋白(enhancexlgreenfluorescentproteinEGFP)報告基因，比較多肽延長因子(elongationfactorlaEFl∞啟動子和巨細胞病毒CMV(cytomegalovinls，CMV)啟動子在人ES細胞中的活性。結(jié)果顯示，在liES細胞中EFla啟動子活性較ClvIV啟動子強。因此，在后續(xù)實驗中我們均采用EFIa啟動予進行研究?；蜣D(zhuǎn)染所需

5、的Fugene6轉(zhuǎn)染試劑具有毒性小、操作簡便、快捷的優(yōu)點，因此我們利用Fugene6將構(gòu)建好的含有EFla啟動子和EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入hES細胞，瞬時轉(zhuǎn)染效率約38％：采用離心的方法，瞬時轉(zhuǎn)染效率可達到3040％。為了進一步提高轉(zhuǎn)染效率，我們決定在hES細胞中引入EBV載體系統(tǒng)。我們采用兩步法建立這一系統(tǒng)：首先，我們采用Fugene6轉(zhuǎn)染試劑將EBNAI基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hES細胞，建立穩(wěn)定表達EBNA1的hES細胞系：然后利用Fugene6轉(zhuǎn)