肺癌細(xì)胞株APC基因甲基化與表達(dá)的研究及模擬肺癌患者血漿中APC基因甲基化的檢測.pdf

1、背景： 近年來表觀遺傳學(xué)(epigenetic)的概念越來越受到關(guān)注，表觀遺傳學(xué)主要指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，包括染色質(zhì)構(gòu)象變化、DNA甲基化及非編碼RNA的調(diào)控。有關(guān)表觀遺傳學(xué)改變是否和遺傳學(xué)改變一樣在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用已經(jīng)爭論了很多年，近些年的研究證實(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中二者不僅都有作用，而且二者在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中還有內(nèi)在的聯(lián)系。 腫瘤細(xì)胞的甲基化模式發(fā)生改變，呈基因組全面的低甲基化和抑癌基

2、因的高甲基化，并認(rèn)為這種異常甲基化模式改變是腫瘤發(fā)生的重要特征。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，抑癌基因失活有兩條途徑：突變和缺失?，F(xiàn)在越來越多的研究表明甲基化是抑癌基因失活的另一重要機(jī)制?，F(xiàn)已證實(shí)，許多抑癌基因的低表達(dá)或失活，直接由基因啟動子甲基化所致，與突變和缺失無關(guān)。抑癌基因的甲基化在腫瘤發(fā)展過程中的作用越來越被人們所認(rèn)識，并成為腫瘤診斷中的一個新興的分子標(biāo)志。 近年來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢，死于腫瘤的男性病人中肺癌已居

3、首位。肺癌因?yàn)樵缙谠\斷困難，往往發(fā)現(xiàn)已經(jīng)是中晚期，給其治療帶來很大困難，死亡率很高，因此尋找新的用于肺癌早期診斷的分子標(biāo)志具有重要的臨床意義。 目的： 研究APC基因甲基化與其表達(dá)的關(guān)系和體外去甲基化干預(yù)對APC基因表達(dá)的影響；研究模擬肺癌患者血漿DNA中APC基因甲基化的最低檢測限，確定不同甲基化檢測技術(shù)在早期肺癌診斷中的應(yīng)用價值。 方法： 提取3株肺癌細(xì)胞(小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446、肺腺癌細(xì)胞

4、株SPCA1、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460)的DNA，分別以經(jīng)轉(zhuǎn)甲基處理和未處理的臍帶血(cord blood，CB)DNA為陽性、陰性對照，亞硫酸氫鹽化學(xué)修飾后，用甲基化特異性基因擴(kuò)增(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)、甲基化基因芯片和克隆測序的方法對APC基因啟動子1A區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究；并用以SYBR Green Ⅰ為熒光染料的實(shí)時熒光定量PCR(

5、real time polymerase chain reaction)和Westem blot技術(shù)，檢測APC基因的表達(dá)；對甲基化陽性的NCI-H460細(xì)胞，分別用不同濃度的5-雜氮-2’-脫氧胞嘧啶(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-dC)試劑進(jìn)行脫甲基化反應(yīng)，用熒光定量PCR及Westem blot術(shù)檢測其表達(dá)變化。以酚/氯仿方法提取NCI-H460細(xì)胞DNA，紫外分光光度計(jì)定量并以10倍稀釋的濃度梯度依次投

6、入相同的200 μl健康人血漿中，從而模擬肺癌患者血漿，利用磁珠核酸提取方法從模擬肺癌患者血漿樣本中提取血漿DNA，對血漿DNA模板進(jìn)行亞硫酸氫鹽化學(xué)修飾，分別以普通MSP、SYBR Green Ⅰ熒光染料和TaqMan熒光探針的熒光定量MSP方法研究血漿中APC基因甲基化最低檢測限。 結(jié)果： 細(xì)胞株NCI-H446和SPCA1的APC基因啟動子甲基化為陰性，而NCI-H460細(xì)胞為陽性，且為等位基因雜合型甲基化；NCI

7、-H460細(xì)胞的APC mRNA轉(zhuǎn)錄較NCI-H446和SPCA1有明顯的下降，分別只有前兩者的26.04％和32.36％，經(jīng)5-aza-dC脫甲基化作用后，NCI-H460細(xì)胞的APC轉(zhuǎn)錄水平增加了約5～10倍；NCI-H446、SPCA1及225 nmol 5-aza-dC脫甲基化作用后NCI-H460細(xì)胞的蛋白表達(dá)分別是NCI-H460細(xì)胞的12.9、7.1、3.52倍。利用熒光探針、熒光染料的熒光定量MSP以及普通MSP檢測模擬

8、肺癌患者血漿APC基因甲基化的最低檢測限分別為每ml血液中30、300、3000個腫瘤細(xì)胞的基因組DNA。因此，利用熒光探針的熒光定量MSP分別比利用熒光染料的熒光定量MSP和普通MSP檢測技術(shù)敏感性高出10倍和100倍。 結(jié)論： APC基因啟動子區(qū)存在的某些區(qū)域高甲基化對APC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)有顯著抑制作用，且在體外可以被脫甲基化試劑5-aza-dC逆轉(zhuǎn)。實(shí)時熒光定量MSP檢測技術(shù)具有高靈敏度，該技術(shù)用于肺癌患者血A