神經(jīng)營養(yǎng)素低親和力受體p75NTR信號傳導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、首先,我們對p75NTR介導(dǎo)的信號通路進(jìn)行了研究,通過酵母雙雜交系統(tǒng)檢測與p75NTR有相互作用的蛋白.該方法理論基礎(chǔ)為:含有異源BD(DNA binding domain)和AD(transcriptional activation domain)的融合蛋白可以借助BD和AD的結(jié)合形成完整的反式作用因子,激活下游報告基因的轉(zhuǎn)錄.結(jié)果如下:1,通過PCR擴增出完整的p75NTR胞內(nèi)區(qū)的cDNA片段p75ICD,克隆至BD表達(dá)載體pAS2

2、-1,與表達(dá)AD的鼠腦cDNApACT2文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母Y190細(xì)胞,通過三營養(yǎng)缺陷(-Trp-Leu-His)、雙報告基因表達(dá)(His,LacZ)的雙重篩選及假陽性的排除,得到多個陽性克隆.2,對這些陽性克隆的測序及同源性分析顯示,一個長約2.7kb的cDNA片段與RanBPM高度同源,并有著相同的讀碼框架.3,在哺乳動物細(xì)胞COS7中共轉(zhuǎn)染p75ICD和RanBPM的真核表達(dá)載體,經(jīng)免疫共沉淀和蛋白印記雜交檢測到這兩個蛋白的表達(dá),

3、并驗證了它們在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合.4,通過PCR擴增出p75NTR胞內(nèi)區(qū)的兩個已知功能結(jié)構(gòu)域的cDNA片段p75dd、p75jux,分別構(gòu)建其酵母表達(dá)載體,通過檢測His報告基因的表達(dá),確認(rèn)RanBPM與p75ICD的結(jié)合位點位于死亡結(jié)構(gòu)域.5,通過PCR擴增出RanBPM蛋白中的SPRY結(jié)構(gòu)域cDNA片段,克隆至Pact2載體得到pACT2-SPRY,通過His報告基因的表達(dá),確認(rèn):單獨的SPRY結(jié)構(gòu)域并不能與p75ICD結(jié)合.其次,我們對

4、凋亡相關(guān)的蛋白ARBP進(jìn)行了克隆和功能研究.我們實驗室在R2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染并表達(dá)了神經(jīng)營養(yǎng)低親和力受體-命名為R2L1細(xì)胞.R2L1細(xì)胞表達(dá)有神經(jīng)營養(yǎng)高親和力受體-TrkA、TrkB,去血清培養(yǎng)后會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,凋亡時間隨培養(yǎng)條件不同而有所改變.通過DDRT-PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)片段LIAREST-1在正常培養(yǎng)和去血清培養(yǎng)的R2L1細(xì)胞中都有表達(dá),但在去血清培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)量顯著上升.基于以上結(jié)果,我們進(jìn)行了如下的深入研究:1,應(yīng)用cDNA末

5、斷快速擴增(RACE)的原理,用基因特異性引物GSP和通用引物AP1聯(lián)合進(jìn)行PCR擴增,篩選大鼠腦cDNA,得到新的延長序列,共901bp,GenBank收錄號為AF304429.2,通過分析發(fā)現(xiàn),該全長序列含有一個編碼109個氨基酸殘基的開放讀碼框架,該蛋白分子量為12.5kD,等電點為10.4,因此將此蛋白命名為凋亡相關(guān)的堿性蛋白(Apoptosis Related Basic Protein,ARBP).3,免疫組化結(jié)果表明,AR

6、BP蛋白在大鼠體內(nèi)有廣泛的分布.4,通過DNA重組技術(shù)建立了ARBP的正義和反義的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染R2L1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了反義表達(dá)載體的R2L1細(xì)胞表現(xiàn)為增殖加快,同時,去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受到抑制.5,構(gòu)建pAS2-1arbp重組質(zhì)粒,與pACT2文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母Y190細(xì)胞,篩選小鼠腦cDNA文庫得到一些cDNA片段,其中一個長1.5kb的片段與突觸相關(guān)蛋白SNAP-25的結(jié)合蛋白-Snapin的cDNA序列高度同源,393b