毛囊干細(xì)胞合成的β-NGF及受體p75NTR在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)早期作用的初步研究.pdf

1、毛囊是一個(gè)由上皮細(xì)胞、神經(jīng)末梢和間質(zhì)細(xì)胞相互作用形成的單位[74]，其發(fā)生和維持涉及到來自不同胚層的二十多種不同種類的細(xì)胞亞群，結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜。這些細(xì)胞在內(nèi)根鞘(IRS)、外根鞘(ORS)、毛干(HS)和真皮乳頭(DP)中棲息生長(zhǎng)，因此發(fā)育生物學(xué)認(rèn)為毛囊是上皮和間充質(zhì)相互作用的一個(gè)極有意義的研究模型[14]。 根據(jù)毛囊的發(fā)育和生長(zhǎng)可將毛囊循環(huán)周期分為四個(gè)階段，即生長(zhǎng)期(anagen)、退化期(catagen)、靜止期(tel

2、ogen)和一個(gè)推測(cè)的活躍脫毛期(exogen)[17,36]。在生長(zhǎng)早期，毛囊下端的上皮細(xì)胞和內(nèi)含的間充質(zhì)真皮乳頭(dermalpapillae，DP)呈球狀向下生長(zhǎng)到達(dá)真皮，KC(keratinocyte，KC)迅速增殖分化形成毛囊的各細(xì)胞群；退化期中，KC突然停止增殖并開始退化，DP內(nèi)以及周圍的細(xì)胞外基質(zhì)降解，DP濃縮、上升并緊鄰毛囊永久部分的隆突部(bulge)。隨后，毛囊進(jìn)入相對(duì)不活動(dòng)的靜止期。毛囊周期依此周而復(fù)始。在毛囊周期

3、循環(huán)過程中，不僅毛囊形態(tài)發(fā)生了很大的變化，而且每一階段的發(fā)育和生長(zhǎng)都受到多種信號(hào)和因子調(diào)節(jié)。 Cotsarelis等采用連續(xù)3H標(biāo)記發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚、睫毛、觸須的毛囊球部并未見標(biāo)記細(xì)胞及干細(xì)胞特征，但可見于隆突區(qū)，而利用脈沖3H標(biāo)記則發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物位于毛母質(zhì)，卻未見于隆突區(qū)，于是提出“隆突激活假說”(bulge-activationhypothesis)[6]。不久前Rochat等研究人類毛囊KC增殖能力時(shí)發(fā)現(xiàn)位于毛囊上部分隆突區(qū)分離細(xì)

4、胞的克隆性生長(zhǎng)能力要遠(yuǎn)大于其他部位分離的細(xì)胞[15]。2000年Taylor等采用Brdu和3H雙標(biāo)記方法同樣證實(shí)HFSC定位于毛囊上段隆突區(qū)[1]。當(dāng)前研究認(rèn)為，這所謂的隆突區(qū)即是HFSC的棲所[7，8]。在2004年，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼闡述在體HFSC特性以及分類，為HFSC的研究奠定了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[9,10,11]。這些研究表明毛囊隆突區(qū)存在一些具有未分化特性、慢周期性并具有較強(qiáng)體外增殖能力的干細(xì)胞。Morris等研究發(fā)現(xiàn)K15

5、啟動(dòng)子在成人的毛囊隆突區(qū)細(xì)胞中具有特異活性[12]，于是利用K15轉(zhuǎn)基因鼠來標(biāo)記并利用細(xì)胞分離技術(shù)分離毛囊隆突區(qū)細(xì)胞和子代細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠在正常毛囊周期中形成新生毛囊的所有上皮層。這些細(xì)胞由一些特定的基因表達(dá)控制，而這些基因表達(dá)也常見于其他種類干細(xì)胞中[9]。同樣，Tumbar等也發(fā)現(xiàn)隆突區(qū)細(xì)胞駐留在干細(xì)胞微環(huán)境的巢時(shí)保持未分化狀態(tài)而一旦脫離干細(xì)胞巢或受到外界刺激時(shí)則改變干細(xì)胞的特性[10]。在2004年，Sieber-Blum等人發(fā)

6、現(xiàn)毛囊中隆突區(qū)存在兩種神經(jīng)嵴來源細(xì)胞，即多潛能干細(xì)胞和神經(jīng)纖維末梢觸覺細(xì)胞(Merkel細(xì)胞)[32，33]。在體外研究發(fā)現(xiàn)，這些多潛能的干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元、許旺細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和其他種類的細(xì)胞。這些結(jié)果突破了以往認(rèn)為HFSC只能定向分化為皮膚細(xì)胞的范疇。以上證據(jù)說明毛囊隆突區(qū)細(xì)胞具有慢周期性并具有強(qiáng)大增殖潛能，為一種成體干細(xì)胞。 多種細(xì)胞參與皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程。在創(chuàng)傷后幾小時(shí)，表皮細(xì)胞開始增殖并遷移以覆蓋

7、暴露的傷口進(jìn)行再上皮化修復(fù)，大量的細(xì)胞因子參與愈合過程，NGF由成纖維細(xì)胞、KC和肥大細(xì)胞等駐留細(xì)胞產(chǎn)生，起重要的生理作用。早在1987年Weskamp與Otten發(fā)現(xiàn)皮膚含有豐富的NGF[18]，隨后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)皮膚中不僅表達(dá)NGF而且還存在其受體[19]。Paus等通過進(jìn)行哺乳動(dòng)物皮膚器官培養(yǎng)首次證明NGF能夠在原位調(diào)節(jié)正常表皮KC的增殖[20]。NGF通過兩種細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)靶細(xì)胞活動(dòng)，即低親和性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75NTR)

8、和高親和性TrkA受體[22]，刺激培養(yǎng)狀態(tài)下人類表皮KC增殖并且抑制其凋亡[21]。局部應(yīng)用NGF能夠加速正常和糖尿病小鼠的表皮創(chuàng)傷愈合率，[23]。皮膚未損傷時(shí)血清中不能探測(cè)到NGF，而當(dāng)全層損傷后血清中NGF水平會(huì)迅速增高。損傷后1天，損傷皮膚NGF水平達(dá)到頂峰，在14天時(shí)回歸到基準(zhǔn)值。原位雜交顯示mRNANGF位于創(chuàng)傷部位的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肉芽組織中。損傷后原位駐留細(xì)胞合成的NGF由各種炎癥因子調(diào)節(jié)。NGF具有一種對(duì)皮膚成

9、纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用的活性，刺激這些細(xì)胞在體外創(chuàng)傷模型中遷移但不影響其增殖、膠原合成和MMP活性[24]。通過添加NGF并進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)p75NTR，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)。這表明NGF可作用創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)晚期階段的成纖維細(xì)胞凋亡[24]。 我們通過五方面的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.HFSC與β-NGF的表達(dá)關(guān)系 首先成功地進(jìn)行了體外分離、培養(yǎng)和鑒定HFSC。DMEM/F12培養(yǎng)基適合細(xì)胞生長(zhǎng)但是

10、其維持細(xì)胞未分化狀態(tài)方面不如KSFM。培養(yǎng)的原代細(xì)胞在第5、6d時(shí)數(shù)量和形態(tài)達(dá)到相對(duì)較好狀態(tài)，超過6d細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變而數(shù)量緩慢增加。在較好狀態(tài)時(shí)細(xì)胞形態(tài)均一，呈鋪路石狀以毛囊隆突區(qū)為中心放射性生長(zhǎng)，可見有絲分裂相。透射電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞核大，核漿比相對(duì)于一般分化細(xì)胞大，表現(xiàn)出原始細(xì)胞形態(tài)特征。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示胞漿表達(dá)β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin。原位雜交顯示mRNAβ-NGF探針標(biāo)記的mRNA

11、位于核膜周圍。圍繞胞核分散放射狀。HFSC分泌的β-NGF在早期(1～4d)呈逐漸上升趨勢(shì)，在第5d達(dá)到最高值，隨后下降，但是下降趨勢(shì)比早期的上升趨勢(shì)較緩和。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明HFSC分泌的β-NGF與非增殖的原代組織分泌的β-NGF在前6d有非常顯著的差別(p＜0.01)，而在第7、8d時(shí)有顯著差別(p＜0.05)。 2.胚胎期大鼠唇部毛囊β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的表達(dá)以及作用

12、在胚胎期大鼠的E15時(shí)期，觸須毛囊剛開始發(fā)育，僅可見一細(xì)胞團(tuán)。隨著時(shí)間的推移，毛囊外部形態(tài)開始顯現(xiàn)。到E19時(shí)可見完整毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)。相應(yīng)因子根據(jù)毛囊發(fā)育的進(jìn)行而變化，大體變化趨勢(shì)如圖2-1所示。 β-NGF在E15表達(dá)量較高，E17.5表達(dá)量最低。整個(gè)過程呈現(xiàn)先高后低，然后再升高的趨勢(shì)。 β1-integrin則呈現(xiàn)穩(wěn)步增高的表達(dá)，即在E15表達(dá)最低，在E19表達(dá)最高。 p75NTR呈現(xiàn)整體降低趨勢(shì)。在E19達(dá)到

13、最低，E15最高。 CD34為穩(wěn)定升高趨勢(shì)，E15表達(dá)最低而E19表達(dá)最高。 K15則為穩(wěn)定升高趨勢(shì)，E15表達(dá)最低，E17.5和E19表達(dá)最高。 3.胚胎期大鼠背部表皮基底層β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的表達(dá)以及作用 在對(duì)胚胎期大鼠背部皮膚研究過程中，可見皮膚的發(fā)育呈逐漸增厚的趨勢(shì)。早在E15時(shí)期，大鼠的背皮非常單薄，容易與皮下組織脫離。不可見皮膚中背皮毛囊。而到E

14、19時(shí)期，皮膚結(jié)構(gòu)相對(duì)緊湊，層次也較鮮明。在表皮下方可見小細(xì)胞群落樣結(jié)構(gòu)，可能為背皮毛囊細(xì)胞。 β-NGF在E15表達(dá)量較高，E17.5表達(dá)量最低。整個(gè)過程為呈現(xiàn)先高后低，然后再升高趨勢(shì)。但是其表達(dá)的變化較觸須毛囊弱。 β1-integrin則呈現(xiàn)先高后低表達(dá)。在E16表達(dá)最高，隨后表達(dá)降低，在E19時(shí)表達(dá)最低。 p75NTR呈現(xiàn)整體降低然后穩(wěn)定的趨勢(shì)。在E15達(dá)到最高，之后平穩(wěn)表達(dá)。 CD34為波浪式變

15、化，E15表達(dá)最低而E16表達(dá)最高。 K15則為先高后低趨勢(shì)，E16表達(dá)最低，E19表達(dá)最高，但是與E15相差不明顯，其趨勢(shì)與β1-integrin相反。 4.表皮全層損傷后毛囊隆突區(qū)的β-NGF、p75NTR、K15、CD34和β1-integrin的變化 表皮全層切除對(duì)機(jī)體造成外界刺激因素，機(jī)體迅速對(duì)其做出反應(yīng)，修復(fù)創(chuàng)傷，促進(jìn)愈合。對(duì)照組為正常組織切片。 全層表皮創(chuàng)傷后β-NGF與對(duì)照組相比在48h變

16、化顯著； β1-integrin與對(duì)照組相比在18h變化顯著； p75NTR與對(duì)照組相比在4h、48h、72h、96h和120h變化顯著； CD34與對(duì)照組相比在24h、72h、120h變化顯著； K15與對(duì)照組相比在6h、12h、24h、36h、48h、120h變化顯著。 5.體外表皮細(xì)胞創(chuàng)傷模型對(duì)HFSC影響 體外表皮細(xì)胞創(chuàng)傷模型中創(chuàng)傷前后培養(yǎng)基中β-NGF含量有非常顯著的差別(p＜0

17、.01)。這提示β-NGF在創(chuàng)傷愈合過程中具有非常重要的生理作用。加入條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了很大的改變，即由未加條件培養(yǎng)基的小而圓、鋪路石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)而多分支狀，細(xì)胞內(nèi)容物增多，鏡下觀察呈顆粒狀。細(xì)胞生長(zhǎng)以及增殖能力下降。Neurofilament200染色顯示細(xì)胞已分化為類似神經(jīng)元的細(xì)胞。CD34呈微弱陽性，β1-integrin及K15表達(dá)呈陰性，提示干細(xì)胞已經(jīng)分化。而未加入條件培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)細(xì)胞則不分化，生長(zhǎng)情況如摘要結(jié)果