靶向P75NTR的siRNA技術誘導U251膠質瘤細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、分類號：R6511密級：學位類別：科學學位一專業(yè)學位口O學校代碼：10062學號：20n702333學科門類：醫(yī)學又坪眚科袁號碩士學位論文MASTER’SDISSERTATIoN論文題目：靶向P75NTR的siRNA技術誘導U251膠質瘤細胞凋亡的實驗研究TITLEAnexperimentalstudyofsiRNAtargetingP75NTRtoinduceapoptosisofU251gliomacells一級學科：臨床醫(yī)學二級學

2、科：外科學神外論文作者：張?zhí)┲笇Ы處煟嚎航裉旖蜥t(yī)科大學研究生院二。一四年五月天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要【目的】膠質母細胞瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。盡管成像技術和多模式的治療方案有了長足發(fā)展，但總的來說，多形性膠質母細胞瘤患者預后很不樂觀。即使給予最為充分的治療，患者的平均存活期中位數(shù)只有1218周，而那些沒有進行干預治療的患者多在診斷后不久死亡。膠質母細胞瘤預后不良主要是由于極高的復發(fā)傾向。有人認為，膠質母細胞瘤在生存到32～

3、36周復發(fā)幾乎不可避免。P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(P75neurotrophirtreceptor，P75NTR)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促進膠質母細胞瘤增殖，抑制凋亡的相關基因。本研究利用RNA干擾(RNAinterfere，RNAi)技術沉默P75N1R在膠質母細胞瘤系U251中的表達，觀察其促進膠質母細胞瘤凋亡的治療效果，為膠質母細胞瘤的基因治療提供新的方法選擇?！痉椒ā竣賃25l膠質瘤細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每3

4、d傳代1次。取生長狀態(tài)良好的U251膠質瘤細胞，實驗前24h換液備用。實驗共分為5組。對照組：常規(guī)培養(yǎng)的U251膠質瘤細胞；空載組：轉染空載質粒的U251膠質瘤細胞；siRNA1～3組：分別轉染序列(1)～(3)的U25l膠質瘤細胞。②RTPCR方法檢測P75N1R的mRNA表達以確定基因沉默效果：利用PrimerPremier50軟件設計相關引物，P75mR引物序列為：上游5’一CGTATTCCGACGAGGCCAACC一3’，下游5

5、’一CCAC從GGCCGAC從CCACAGG一3’，產(chǎn)物大小為286bp：GAPDH引物序列為：上游5’一CGGAGTCAACGGATTTGGTAT一3’，下游5’一AGccTTcTCcATGGTGGTG從GAc一3’，產(chǎn)物大小為598bp。③繪制細胞生長曲線：將獲得最佳基因沉默效果的穩(wěn)定基因轉染的U251細胞作為RNAi組置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第24、48、72、96、120、144h行細胞計數(shù)，繪制細胞生長曲線。④原位細胞凋亡

6、實驗檢測細胞凋亡情況⑤Westernblot方法檢測穩(wěn)定轉染后第3天時P75mR、促凋亡基因Caspase一3和凋亡抑制基因BcI2的蛋白表達?！窘Y果】①RTPCR檢測結果空載組及對照組U251膠質瘤細胞系均高表達P75NTRmRNA，轉染P75NTRsiRNA質粒后U251細胞P75NrR的mRNA表達水平顯著下降。②細胞生長曲線對照組和空載組細胞增殖旺盛，RNAi組細胞增殖速度在幾個檢測時間點均明顯低于對照組和空載組，即細胞增殖能力