長鏈非編碼RNA在小鼠脂肪組織胰島素抵抗中的表達譜特征及其對脂肪細胞胰島素敏感性的影響.pdf

1、肥胖是目前發(fā)達國家和發(fā)展中國家共同面臨的全球性公共衛(wèi)生難題。內(nèi)臟脂肪的堆積會導致代謝性疾病，包括心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等。胰島素抵抗是2型糖尿病和多種心血管疾病的共同發(fā)病機制。胰島素抵抗是指細胞或組織對正常劑量的胰島素反應性下降。引起胰島素抵抗的原因有很多，包括肥胖相關的慢性炎癥狀態(tài)、脂代謝異常、腸道菌群失調(diào)等。對胰島素信號通路的研究已經(jīng)有很多，而最近又有新的研究發(fā)現(xiàn)轉錄調(diào)控和表觀遺傳學修飾在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用。

2、r>　　長鏈非編碼RNA(LncRNA)是轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA，且大部分lncRNA幾乎無編碼蛋白質(zhì)功能。所以最初這些RNA分子被認為沒有生物學活性。但現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在許多生物學過程中起著作用，包括遺傳學印記、轉錄激活、RNA剪切、核內(nèi)運輸?shù)?。LncRNA也能參與脂肪的形成與分化，有研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA能與過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）結合參與調(diào)控脂肪的分化、生成。PPARγ的表達能影

3、響抵抗素和一些促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而與胰島素抵抗相關。所以我們猜測lncRNA可能也參與調(diào)控了脂肪組織發(fā)生胰島素抵抗的這一病理過程。
　　在本研究中，我們通過高脂喂養(yǎng)C57BL6小鼠12周來誘導產(chǎn)生胰島素抵抗模型，在鑒定模型建立成功后，將小鼠附睪脂肪組織送第二代高通量測序，了解lncRNA在正常小鼠附睪脂肪組織以及發(fā)生胰島素抵抗的脂肪組織中表達差異情況，從而篩選出對胰島素抵抗可能有影響的lncRNA。隨后，將小鼠3T3-L1前脂

4、肪細胞誘導為成熟脂肪細胞，通過基因干擾技術體外沉默胰島素抵抗脂肪組織中過表達的lncRNA，觀察其對脂肪細胞胰島素敏感性的影響。
　　第一部分長鏈非編碼RNA在小鼠脂肪組織胰島素抵抗中的表達譜特征
　　目的:
　　研究lncRNAs在小鼠正常和發(fā)生胰島素抵抗的附睪脂肪組織中表達譜的差異特征。篩選與胰島素抵抗相關的lncRNAs，為后續(xù)的研究提供基礎。
　　方法:
　　將20只5周齡健康雄性C57BL6小鼠適

5、應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常飲食組（NCD10只/組）和高脂飲食組（HFD10只/組）。NCD組用普通標準飼料(10％脂肪)喂養(yǎng)，HFD組用高脂飼料（60％脂肪）喂食12周來建立胰島素抵抗模型。隨后通過口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和胰島素耐量試驗(ITT)來評估胰島素抵抗模型是否成功。測量比較兩組小鼠的體重、附睪脂肪重量。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察附睪脂肪細胞面積。Real-time PCR檢測小鼠脂肪組織炎癥指標白介素-6(IL-

6、6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA表達。Western blotting檢測脂肪細胞p-Akt(S473)和Akt蛋白表達。第二代高通量測序檢測兩組小鼠附睪脂肪組織中l(wèi)ncRNA的表達情況，并選擇表達差異在3倍以上的lncRNA行Real-time PCR驗證。對差異表達的lncRNA進行GO分析和KEGG通路分析。
　　結果:
　　與NCD組比較，HFD組小鼠體重及附睪脂肪重量明顯增加(P＜0.01)，附睪脂肪

7、細胞面積顯著增加，糖耐量異常和胰島素抵抗明顯。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HFD組附睪脂肪組織中IL-6和TNF-α表達顯著高于NCD組(P＜0.01)。二代高通量測序發(fā)現(xiàn)，與NCD組比較，HFD組附睪脂肪組織中有71條lncRNA和2985條mRNA表達顯著增高(P＜0.05);有145條lncRNA和2472條mRNA表達顯著下降(P＜0.05)。Real-time PCR表達差異在3倍以上的lncRNA共15條，其表達趨勢

8、與高通量測序結果基本一致。GO分析結果提示差異表達的lncRNA主要涉及膜結合的細胞組分、蛋白綁定、催化酶的活性、細胞內(nèi)各種化合物以及核酸的代謝過程等，KEGG通路分析結果提示差異表達的lncRNA參與的信號通路主要涉及酒精中毒、免疫炎癥、癌癥的轉錄失調(diào)、以及代謝途徑等，與胰島素抵抗相關。
　　結論:
　　高脂飲食可使得C57BL6小鼠發(fā)生胰島素抵抗。長鏈非編碼RNA表達譜在小鼠正常白色脂肪組織和發(fā)生胰島素抵抗的白色脂肪組織

9、中表達差異顯著，提示lncRNA可能在脂肪組織胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　第二部分 LncRNA對小鼠脂肪細胞胰島素敏感性的影響
　　目的:
　　探討根據(jù)第一部分篩選出的上調(diào)的lncRNAs在小鼠3T3-L1誘導分化的成熟脂肪細胞以及發(fā)生胰島素抵抗的脂肪細胞中的表達差異情況，并觀察其對葡萄糖攝取率、PPARγ、GLUT4、IL-6的mRNA表達和Akt蛋白及其磷酸化水平的影響
　　方法:
　　通

10、過lmg/ml胰島素、10mmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)將小鼠3T3-L1細胞誘導分化為成熟的脂肪細胞。油紅O染色以及Real-timePCR檢測脂肪細胞形成標志基因Fabp4和PPARγ的表達情況，鑒定是否為成熟脂肪細胞。采用400μmol/L棕櫚酸(PA)刺激48小時建立細胞胰島素抵抗模型。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法比較正常對照組(CON)和棕櫚酸刺激組(PA)葡萄糖的濃度并計算各組的

11、葡萄糖攝取率，Real-time PCR檢測兩組脂肪細胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表達，Western blotting檢測各組脂肪細胞Akt蛋白及其磷酸化水平。Real-time PCR檢測根據(jù)第一部分實驗結果篩選出的lncRNA在普通培養(yǎng)的脂肪細胞（CON組）和發(fā)生胰島素抵抗的脂肪細胞（PA組）中的表達情況。根據(jù)Real-timePCR結果，選擇在兩組間表達差異明顯的lncRNA，使用RNA干擾技術沉默相關lncR

12、NA（siRNA組），選擇與目的基因序列無同源性的siRNA作為陰性對照(NC組)。根據(jù)是否加棕櫚酸將細胞分為以下四組，NC組，siRNA組，NC+PA組，siRNA+PA組，計算各組的葡萄糖攝取率，各組脂肪細胞PPARγ、GLUT4、IL-6mRNA的表達和Akt蛋白及其磷酸化水平。
　　結果:
　　小鼠3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)誘導分化為成熟脂肪細胞，油紅O染色后于光鏡下可見分化成熟的脂肪細胞內(nèi)的脂滴被染成橘紅色，Real

13、-time PCR顯示Fabp4和PPARγ的mRNA水平顯著增加。PA刺激后，脂肪細胞的葡萄糖攝取率下降，PPARγ、GLUT4mRNA表達減少，IL-6 mRNA表達升高，Akt的磷酸化水平下降。在第一部分中篩選出來的15條上調(diào)的lncRNA中，有9條在體外培養(yǎng)的脂肪細胞中也存在PA組表達顯著高于CON組的情況。通過對其中3條候選的lncRNA(Gm26870、Gpr137b-ps、TCONS_01864186)進行功能缺失性研究發(fā)