胰島素抵抗基因敏感性及相關(guān)信號(hào)表達(dá)與調(diào)控.pdf

1、【背景】
　　糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一種代謝紊亂性疾病，其特征是高血糖、靶組織對(duì)胰島素敏感性不足和/或胰島素分泌缺陷。2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病總發(fā)病的80-85％。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，T2DM具有多因子遺傳性，又與后天生活飲食和行為習(xí)慣有密切關(guān)系。遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致T2DM的發(fā)生，但遺傳因素和環(huán)境因素有無相互作用還未見報(bào)道。T2DM的典型特

2、征是胰島素抵抗（Insulinresistance，IR）導(dǎo)致持續(xù)性高血糖。盡管T2DM的具體發(fā)病機(jī)制還不明確，大量的研究證實(shí)，氧化應(yīng)激與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在IR的發(fā)生中起著致因性的作用。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，ROS不僅是體內(nèi)代謝的垃圾和機(jī)體的有害物質(zhì)，在一定劑量范圍內(nèi)，ROS還作為一種信號(hào)分子，對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)起著調(diào)節(jié)作用。
　　齊墩果酸（Oleanolicaci

3、d，OA）是一種天然三萜系化合物，并且是許多皂苷的苷配基。OA在我國(guó)的傳統(tǒng)中藥中已經(jīng)有20多年的使用歷史，主要是用來治療肝臟疾病，比如病毒性肝炎。OA吸收后主要在肝臟代謝分布預(yù)先給予小鼠OA，可以降低由于化學(xué)肝毒物引起的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的升高并減輕肝小葉中心壞死。
　　【目的】
　　(1)研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)IR基因敏感性差異。
　　(2)探討ROS對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　(3)研究OA的抗氧化活

4、性、降血糖和改善肝細(xì)胞IR的作用機(jī)制。
　　【方法】
　　(1)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)IR的基因敏感性差異研究。高脂高糖飼料的基礎(chǔ)上，給大鼠注射小劑量tBHP，誘導(dǎo)大鼠差異性產(chǎn)生IR。利用基因芯片，篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織糖尿病相關(guān)基因mRNA表達(dá)差異，尋找氧化應(yīng)激誘導(dǎo)IR的易感性差異基因。并測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清、肝、脂肪和肌肉組織的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否存在氧化損傷的差異。
　　(2)ROS信號(hào)對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)的調(diào)節(jié)作用及

5、其機(jī)制研究。采用QZG人正常肝細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用tBHP、葡萄糖+葡萄糖氧化酶系統(tǒng)和H2O2三種ROS生成系統(tǒng)，以胰島素刺激的Akt、GSK3α/β和mTOR的磷酸化的改變?yōu)榕卸ㄖ笜?biāo)，研究不同濃度ROS生成系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)影響的劑量效應(yīng)關(guān)系。并使用DCFH-DA為探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，分離細(xì)胞線粒體，測(cè)定線粒體膜電位，通過透射電鏡觀察線粒體形態(tài)，同時(shí)使用westernblot和RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)定MAPKs

6、以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，研究氧化還原平衡、線粒體功能等對(duì)ROS干擾胰島素信號(hào)的影響。
　　(3)OA的抗氧化活性、抗糖尿病和對(duì)肝細(xì)胞IR的保護(hù)作用及其機(jī)制研究。通過體外建立羥自由基和超氧陰離子魯米諾化學(xué)發(fā)光體系和DPPH自由基生成體系，并在亞細(xì)胞水平構(gòu)建CHP、Vc/Fe2+、CCl4/NADP+激發(fā)的微粒體脂質(zhì)過氧化損傷模型，建立抗氧化活性評(píng)價(jià)技術(shù)平臺(tái)，檢測(cè)OA對(duì)平臺(tái)各體系激發(fā)生成的自由基及丙二醛含量的影響。并通過tBHP誘

7、導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷，使用DCFH-DA為探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，測(cè)定GSH和GSSG含量，MTT測(cè)定細(xì)胞活力，western blot測(cè)定Nrf2、相關(guān)抗氧化酶以及MAPKs的表達(dá)變化，研究OA對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，及Nrf2調(diào)控的氧化還原平衡和MAPKs的影響。還利用STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病樣改變，研究腹腔注射OA對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響，體外測(cè)定OA對(duì)α淀粉酶活性的影響，并使用200μMtBHP誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生IR，westernbl

8、ot測(cè)定胰島素信號(hào)和MAPKs磷酸化的改變，RT-PCR測(cè)定氧化應(yīng)激和糖代謝相關(guān)指標(biāo)，分離線粒體測(cè)定線粒體膜電位，研究OA對(duì)肝細(xì)胞IR的保護(hù)作用及可能機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　(1)高脂高糖飼料的基礎(chǔ)上，給大鼠注射氧化劑tBHP4周后，一部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（IBG）血糖顯著升高并發(fā)生IR，而另一部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（NBG）血糖未發(fā)生顯著性改變也未發(fā)生IR。肝組織糖尿病相關(guān)基因芯片結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激條件下，IBG和NBG組大鼠的糖尿病相關(guān)

9、基因出現(xiàn)了明顯分離性表達(dá)，即一部分為糖尿病性敏感性表達(dá)，而另一部分為非敏感性表達(dá)，其中變化最為顯著的是轉(zhuǎn)錄因子2（transcription factor 2，TCF2），也稱為肝細(xì)胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor，HNF1β）。敏感組較較不敏感組TCF2表達(dá)下調(diào)60倍以上，不敏感組較正常對(duì)照組TCF2表達(dá)明顯上調(diào)。敏感組動(dòng)物受到明顯的氧化損傷，抗氧化能力明顯減弱。
　　(2)不同劑量的tBHP、葡

10、萄糖+葡萄糖氧化酶系統(tǒng)和H2O2三種ROS生成系統(tǒng)顯著地影響了胰島素刺激的Akt、GSK3α/β和mTOR等信號(hào)的磷酸化?？傮w趨勢(shì)表現(xiàn)為低劑量ROS促進(jìn)Akt信號(hào)的傳導(dǎo)，高劑量的ROS抑制Akt信號(hào)，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。在三種ROS生成系統(tǒng)中，tBHP和H2O2主要表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)MAPKs的磷酸化，高劑量抑制其磷酸化。葡萄糖+葡萄糖氧化酶系統(tǒng)則隨著濃度的升高，MAPKs的磷酸化逐漸增強(qiáng)。低劑量的三種ROS生成系統(tǒng)明顯地使抗氧化核心

11、轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）表達(dá)增強(qiáng)并使細(xì)胞抗氧化酶介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)增強(qiáng)，但隨著隨著ROS濃度的升高，細(xì)胞抗氧化防御能力逐漸減弱。低劑量的三種ROS生成系統(tǒng)使TCF2表達(dá)顯著增強(qiáng)，而高劑量的ROS又使TCF2的表達(dá)顯著降低。低劑量的tBHP使胰島素刺激的PCK2mRNA表達(dá)顯著降低，而隨著濃度升高，tBHP又促進(jìn)PCK2的表達(dá)。線粒體膜電位結(jié)果顯示，低劑量的三種ROS生成系統(tǒng)對(duì)線粒體膜電位無顯著影響，而在高劑量的條件下，三種ROS生成系統(tǒng)使

12、線粒體膜電位顯著降低。此外，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)200μMtBHP使線粒體明顯受到損傷，而給予抗氧化劑明顯逆轉(zhuǎn)tBHP對(duì)線粒體的損傷。使用線粒體酶復(fù)合物Ⅱ抑制劑（3NP）明顯地抑制了低劑量tBHP對(duì)胰島素刺激的Akt信號(hào)的促進(jìn)作用。使用線粒體保護(hù)劑（環(huán)孢霉素A）明顯地減弱高劑量tBHP對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)的抑制作用。不同濃度的tBHP還劑量依賴性地促進(jìn)以BSA和胰島素為底物的AGEs的形成。
　　(3)自由基模型和脂質(zhì)過氧化模型結(jié)果顯示

13、,OA具有一定的自由基清除作用和抑制脂質(zhì)過氧化作用，但是OA對(duì)自由基的直接作用并不強(qiáng)。體外細(xì)胞氧化損傷模型結(jié)果顯示，OA可以明顯保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，明顯抑制tBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低，促進(jìn)GSH的生成而降低GSSG的含量，并上調(diào)Nrf2和抗氧化酶CAT和PRX1的表達(dá)，并促進(jìn)ERK和JNK的磷酸化。OA對(duì)糖尿病大鼠的作用顯示，預(yù)防性和治療性給予OA都可使糖尿病大鼠血糖顯著降低，OA可以有效預(yù)防并阻止STZ誘導(dǎo)的T1DM。OA還使大鼠

14、在實(shí)驗(yàn)期間體重增加明顯減慢。OA明顯地保護(hù)STZ誘導(dǎo)的大鼠胰腺和肝臟的病理損傷。OA顯著地促進(jìn)正常條件下胰島素的信號(hào)分子傳導(dǎo)并明顯改善tBHP誘導(dǎo)的IR。預(yù)防性或治療性給予OA明顯地促進(jìn)MAPKs的磷酸化。OA能使tBHP誘導(dǎo)的PCK2的mRNA表達(dá)明顯降低。OA還明顯地保護(hù)tBHP對(duì)線粒體膜電位的損傷。然而，OA對(duì)α淀粉酶活性無明顯影響。
　　【結(jié)論】
　　(1)TCF2是決定胰島素抵抗發(fā)生易感性的關(guān)鍵因子。
　　高

15、脂高糖氧化應(yīng)激動(dòng)物出現(xiàn)IR分離性表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有45％受試動(dòng)物具有糖尿病易感性，表現(xiàn)為有一系列的基因表達(dá)異常，其中Nrf2與TCF2、PPARγ以及其它一系列的抗氧化酶表達(dá)的變化趨勢(shì)非常相似，但TCF2變化最為顯著。這些發(fā)現(xiàn)表明，TCF2與以Nrf2為核心的氧化還原平衡之間有著密切的關(guān)系。TCF2是否為決定生物體在氧化應(yīng)激條件下發(fā)生IR甚至于T2DM的關(guān)鍵因子，有待于進(jìn)一步證明。
　　(2)ROS對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)具有劑量依賴性的雙重

16、調(diào)控作用。
　　在生理?xiàng)l件下，低劑量的ROS可以促進(jìn)胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，而高劑量的ROS可以干擾胰島素信號(hào)的正常傳遞，誘導(dǎo)IR的發(fā)生，提示ROS對(duì)胰島素信號(hào)的作用具有劑量依賴性，ROS水平的變化起著雙刃劍的作用。Nrf2調(diào)控的氧化還原平衡可能是ROS調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)的關(guān)鍵。此外，MAPKs和線粒體功能可能是介導(dǎo)ROS調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)的重要因素。
　　(3)OA可以Nrf2為靶點(diǎn)有效地降低血糖、改善肝臟胰島素抵抗。
　　OA具

17、有自由基清除作用，是一種可以通過生物學(xué)作用誘導(dǎo)抗氧化防御系統(tǒng)而間接發(fā)揮抗氧化作用的抗氧化劑。與自由基清除作用相比，OA的間接生物學(xué)作用更為重要。OA通過誘導(dǎo)Nrf2上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)GSH的生成而發(fā)揮抗氧化作用，可能主要通過間接地激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化酶系統(tǒng)而發(fā)揮抗氧化作用。此外，JNK和ERK的磷酸化參與OA發(fā)揮抗氧化作用，而且在MAPKs和Nrf2之間很可能存在某種cross-talks。OA可以降血糖、改善肝臟IR、抑