人胚胎干細(xì)胞建系相關(guān)影響因素研究.pdf

1、本研究在前期鼠胚胎干細(xì)胞建系的基礎(chǔ)上，利用本中心新鮮廢棄胚胎，從囊胚質(zhì)量與結(jié)局的關(guān)系，兩種不同培養(yǎng)方法，有效分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法和最佳傳代時(shí)機(jī)等四個(gè)方面，對(duì)影響成功建系的因素進(jìn)行分析，探尋可靠、高效建立人胚胎干細(xì)胞的方法，為最終成功建立人胚胎干細(xì)胞系提供方法指導(dǎo)和理論依據(jù)。 方法 1、取孕12．5-14．5天昆明小鼠的胎鼠，制作鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。 2、收集本中心2005年5月至2007年1月間進(jìn)行的IVF-

2、ET周期新鮮廢棄胚胎，培養(yǎng)至囊胚并評(píng)分。所有用于研究的胚胎均經(jīng)患者知情同意。 3、囊胚隨機(jī)分為兩組，一組去透明帶后直接置于飼養(yǎng)層進(jìn)行全胚培養(yǎng)；另一組使用免疫外科法分離ICM后再接種于飼養(yǎng)層培養(yǎng)。記錄每個(gè)囊胚貼壁、原代克隆形成及傳代情況。 4、免疫外科法分離ICM時(shí)囊胚置于四組不同濃度的兔抗人血清和新鮮豚鼠血清中，觀察滋養(yǎng)外胚層去除和ICM完整情況。 5、免疫法分離出ICM置于ES培養(yǎng)微滴中培養(yǎng)，隔日換液，分

3、別于培養(yǎng)D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12分別用染料著色方法檢測(cè)ICM ES樣標(biāo)記堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)胚胎表面階段特異性標(biāo)記4(stage specific embryorlic antigen 4，SSEA-4)的表達(dá)情況。 結(jié)果 1、胚胎收集及培養(yǎng)情況本實(shí)驗(yàn)共收集D3新鮮廢棄胚胎共257枚，體外培養(yǎng)后102枚發(fā)育至囊胚，囊胚形成率

4、為39．7％，其中用于建系的3-4AA級(jí)/3-4BA級(jí)囊胚13枚，3-4AB級(jí)/3-4BB級(jí)23枚，3CC級(jí)15枚。余51枚用于檢測(cè)培養(yǎng)不同天數(shù)ICM ES樣標(biāo)記表達(dá)情況。 2、囊胚質(zhì)量與結(jié)局3-4AA級(jí)/3-4BA級(jí)囊胚：13枚，接種12枚，貼壁11枚，貼壁率為91．7％，形成典型克隆4個(gè)，克隆形成率為33．3％，可傳代2個(gè)，傳代率16．7％。 3-4AB級(jí)/3-4BB級(jí)囊胚：23枚，接種20枚，貼壁14枚，貼壁率

5、為70％，形成典型克隆5個(gè)，克隆形成率為25％，可傳代1個(gè)，傳代率5％。 3CC級(jí)囊胚：15枚，接種5枚，貼壁0枚，形成克隆0個(gè)，傳代0個(gè)。 3-4AA級(jí)/3-4BA級(jí)和3-4AB級(jí)/3-4BB級(jí)囊胚各項(xiàng)指標(biāo)均高于3CC級(jí)，3-4AA級(jí)/3-4BA級(jí)囊胚傳代率高于3-4AB級(jí)/3-4BB級(jí)囊胚，P<0．05，而貼壁率和原代克隆形成率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0．05。 3、不同培養(yǎng)方法對(duì)原代克隆生長(zhǎng)的影響全胚培養(yǎng)法

6、：囊胚19枚，貼壁10個(gè)，貼壁率為52．6﹪，形成典型的原代克隆3個(gè)，克隆形成率為15．8％，均為能傳代。免疫外科法：囊胚32個(gè)，分離出完整的進(jìn)行接種ICM18個(gè)，貼壁15個(gè)，貼壁率為83．3％，形成典型的原代克隆6個(gè)，克隆形成率為33．3％，其中三個(gè)傳至3代，停止增殖，未能建系。 兩種培養(yǎng)方法比較，免疫外科法組的貼壁率、克隆形成率及傳代數(shù)均高于全胚培養(yǎng)法組，P<0．05。 4、不同濃度血清免疫法分離ICM比較1：8

7、兔抗人血清+1：8新鮮豚鼠血清：滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞無(wú)明顯改變，完全不能去除。 1：4兔抗人血清+1：4新鮮豚鼠血清：滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞少量細(xì)胞腫脹，去除不完全。 1：2兔抗人血清+1：2新鮮豚鼠血清：外滋養(yǎng)細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)全部溶解。 1：2兔抗人血清+1：4新鮮豚鼠血清：外滋養(yǎng)細(xì)胞腫脹，去除完全，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)完整。 5、體外培養(yǎng)不同天數(shù)ICM AKP活性和SSEA一4表達(dá)情況AKP活性：體外培養(yǎng)至D5、D6、D

8、7 ICM著色后為藍(lán)紫色，呈陽(yáng)性(+)表達(dá)；D8、D9、D10著色漸淡，部分區(qū)域不著色，呈弱陽(yáng)性(±)；D11、D12 ICM完全不著色，呈陰性(-)。 SSEA-4：體外培養(yǎng)至D5、D6、D7、D8 ICM熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)發(fā)出綠色熒光，呈陽(yáng)性(+)表達(dá)；D9、D10綠色熒光漸暗，呈弱陽(yáng)性(±)；D11、D12 ICM不再有熒光，鏡下僅見(jiàn)細(xì)胞間界限明顯的細(xì)胞團(tuán)，SSEA-4表達(dá)呈陰性(-)。 結(jié)論

9、 1、原代建系建議使用3BB級(jí)以上的囊胚。質(zhì)量差的囊胚，細(xì)胞數(shù)目少、增殖能力差，不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增傳代。 2、免疫外科法在分離ICM的同時(shí)也是對(duì)質(zhì)量差的胚胎的淘汰，去除滋養(yǎng)外胚層減少了外滋養(yǎng)細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)共培養(yǎng)對(duì)其產(chǎn)生的誘導(dǎo)分化作用，從而提高貼壁率和原代克隆形成率，是一種更為高效的原代培養(yǎng)方法。 3、免疫囊胚刀采用1：2倍比稀釋的兔抗人血清和1：4倍比稀釋的新鮮豚鼠血清可在有效去除滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的同時(shí)保證內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的完