小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)影響因素的研究.pdf

1、 該研究主要探討小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)影響因素.小鼠胎兒成纖維細(xì)胞用5μg/ml的絲裂霉素處理4h,10μg/ml的絲裂霉素處理1~4h或20μg/ml的絲裂霉素處理1~2.5h,其隨后培養(yǎng)2d-7d的A值無顯著變化(p<0.05):用14、21、28GRAY的γ射線處理1h,其隨后培養(yǎng)1-5d的A值亦無顯著變化(p>0.05).在培養(yǎng)液中添加1,1.5,2×10<'3>IU/ml的白血病抑制因子能顯著提高小鼠胚胎干細(xì)胞的AKP染色陽

2、性度(有飼養(yǎng)層培養(yǎng):17.80±3.26、19.58±3.19、21.8±3.17 vs 2.73±0.22;p<0.05;無飼養(yǎng)層培養(yǎng):14.14±2.35、17.87±2.38、19.21±2.92 vs 0.053±0.0125;p<0.05)及克隆形成率(有飼養(yǎng)層培養(yǎng):29.1％、31.8%、33.5%vs6.9%;p<0.05;無飼養(yǎng)層培養(yǎng):24.7%、27.8%、31.2%vs 05%;p<0.05);無論是否采用飼養(yǎng)層,不

3、同濃度白血病抑制因子之間的AKP染色陽性度及克隆形成率差異不顯著(p>0.05);而當(dāng)不添加白血病抑制因子時(shí),飼養(yǎng)層能顯著地提高胚胎干細(xì)胞的AKP染色陽性度及克隆形成率(2.73±0.22 vs0.053±0.0125;6.9%vs 0.5%;p<0.05).胚胎干細(xì)胞在3種培養(yǎng)用水(Sigma細(xì)胞測(cè)定水、過亞沸Milli Q、Milli Q水)配制的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,三種水的胚胎干細(xì)胞的克隆形成率無顯著差異(p>0.05),但過亞沸M

4、illi Q水的胚胎干細(xì)胞克隆AKP染色陽性度顯著高于Milli Q水(16.35±2.21 vs 11.10±1.40;p<0.05),而與Sigma細(xì)胞測(cè)定水相比無顯著差異(p>0.05).胚胎干細(xì)胞在4種血清(優(yōu)質(zhì)胎牛血清批次1、優(yōu)質(zhì)胎牛血清批次2、實(shí)驗(yàn)室自制的胎牛血清、商品新生牛血清)中培養(yǎng)5d,優(yōu)質(zhì)胎牛血清的克隆形成率和AKP染色陽性度均顯著高于自制胎牛血清和商品新生牛血清(25.4%、24.5%vs 17.9%、16%,p<

5、0.05;14.73±0.67、14.32±0.80 vs 11.76±0.55、10.59±1.09,p<0.05).以上結(jié)果表明:(1)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞用適當(dāng)濃度的的絲裂霉素或適當(dāng)強(qiáng)度的γ-射線處理一定的時(shí)間能有效地抑制其分裂,且不影響其活力;(2)飼養(yǎng)層細(xì)胞在小鼠胚胎干細(xì)胞的分化抑制過程中有一定作用,而起主導(dǎo)作用的是外源白血病抑制因子;(3)經(jīng)亞沸處理的Milli Q水,能顯著提高小鼠胚胎干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的能力;(4)血清的