大鼠單倍體胚胎干細(xì)胞建系及功能研究.pdf

1、大鼠是最早被應(yīng)用于科學(xué)研究的哺乳類模式動(dòng)物。雖然小鼠作為模式動(dòng)物廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究，但和小鼠相比，大鼠體現(xiàn)出了很多優(yōu)勢，比如大鼠體型比小鼠大很多，便于進(jìn)行各種外科手術(shù)，并且與小鼠相比在生理調(diào)節(jié)和藥理反應(yīng)等方面與人類的更相近，因此大鼠已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生理學(xué)、免疫學(xué)、移植醫(yī)學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、癌癥學(xué)、遺傳學(xué)和老化等領(lǐng)域。1981年第一株小鼠胚胎干細(xì)胞系被成功建立，其能夠在體外無限擴(kuò)增，且具有發(fā)育的多能性，因此在基因功能研究、基因修飾以及細(xì)胞治療

2、和臨床等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。第一只克隆小鼠由日本科學(xué)家Wakayama首次成功完成，雖然之后大鼠克隆也由周琪通過調(diào)整卵母細(xì)胞激活周期而完成，但一直以來大鼠胚胎干細(xì)胞沒有被成功建立，因此在構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型領(lǐng)域，大鼠的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于小鼠。2008年，華人科學(xué)家應(yīng)其龍等利用無血清培養(yǎng)體系，即基礎(chǔ)培養(yǎng)液N2B27添加GSK3及ERK/MEK信號通路的抑制因子(2i: CHIR99021，PD0325901)及大鼠Lif，首次建立了具有種

3、系嵌合能力的真正的大鼠胚胎干細(xì)胞系，從而解決了限制大鼠轉(zhuǎn)基因模型研究的瓶頸。但是相比較于小鼠，獲得轉(zhuǎn)基因大鼠以及基因敲除大鼠仍然花費(fèi)更大，這嚴(yán)重影響了大鼠模型在生物研究及醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　2010年，研究人員建立了斑馬魚的單倍體胚胎干細(xì)胞系，這些單倍體干細(xì)胞只有一套染色體，因此通過正反向遺傳篩選技術(shù)能夠快速地分析哺乳動(dòng)物發(fā)育和一些性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可以建立產(chǎn)生純合子基因突變文庫作為發(fā)現(xiàn)基因-性狀的資源。2011年，第一株哺乳

4、動(dòng)物孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞被建立，使得哺乳動(dòng)物單倍體胚胎干細(xì)胞成為了年度研究的熱點(diǎn)。2012年，周琪研究組和李勁松研究組同時(shí)建立了孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系，證明了這些細(xì)胞仍然具有雄性配子功能——這些細(xì)胞能夠代替精子，注入卵母細(xì)胞后可以產(chǎn)生健康的小鼠。
　　本研究探索了獲得單倍體孤雄及孤雌胚胎的“精子克隆法”和“受精卵去原核法”兩種方法，比較了單倍體胚胎體內(nèi)和體外的發(fā)育效率，獲得了大鼠單倍體囊胚繼而在優(yōu)化后的5％knock-outser

5、umreplacement的N2B27并添加抑制因子PD0325901，CHIR99021，A8301，Y27632以及Lif的培養(yǎng)體系中完成了大鼠孤雄及孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞的建系。
　　從克隆形態(tài)上看，大鼠單倍體胚胎細(xì)胞系具有典型的大鼠胚胎干細(xì)胞形態(tài)，呈克隆狀，貼壁或懸浮生長。通過流式細(xì)胞分選技術(shù)對大鼠單倍體胚胎細(xì)胞系根據(jù)DNA含量進(jìn)行分選，通過數(shù)次分選可以將單倍體細(xì)胞富集。大鼠單倍體胚胎細(xì)胞系具有大鼠單倍體（21條）核型，體外

6、培養(yǎng)超過30代的大鼠單倍體胚胎細(xì)胞系進(jìn)行aCGH實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，體外經(jīng)過反復(fù)傳代后的大鼠單倍體胚胎干細(xì)胞系具有完整的大鼠單倍基因組，并且沒有明顯的拷貝數(shù)變異。從多能性角度分析，大鼠單倍體胚胎細(xì)胞系具有較高的多能性水平，主要體現(xiàn)在:堿性磷酸酶染色結(jié)果呈陽性;經(jīng)RT-PCR，免疫熒光染色和western blot等方法檢測，我們所建立的大鼠單倍體胚胎干細(xì)胞系表達(dá)Oct4，Nanog，Sox2和SSEA-1等細(xì)胞多能性marker;能夠維持自我更

7、新且具有無限傳代能力;在隨機(jī)分化條件下可以在體外分化成擬胚體（Embryoid bodys，EBs）;體內(nèi)囊胚嵌合實(shí)驗(yàn)可以得到高比例嵌合的二倍體嵌合體大鼠，且大部分嵌合體大鼠可以存活至成年，將獲得的雌性嵌合體大鼠與SD品系雄性大鼠交配后能夠得到種系嵌合的子代大鼠，這首次證明了單X染色體的單倍體孤雄胚胎干細(xì)胞具有種系傳遞能力;利用大鼠單倍體胚胎干細(xì)胞的單倍性以及其可自我更新和復(fù)制的干細(xì)胞特點(diǎn)用PB轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)進(jìn)行隨機(jī)位點(diǎn)插入和基因捕獲操作獲