鹽藻DsSTPK基因的載體構建、原核表達及亞細胞定位分析.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina,以下簡稱鹽藻)是公認的能夠耐受高鹽的低等真核生物,是研究植物高鹽適應的模式生物。多年以來,許多學者從鹽藻適應高鹽環(huán)境的滲透調節(jié)、耐鹽相關基因的克隆及質膜、胞漿蛋白質等方面進行了研究,取得了一定的進展。但到目前為止,對其耐鹽的分子機制和信號轉導途徑仍不清楚。細胞應對各種外界刺激的主要調節(jié)機制是對通路蛋白的磷酸化。蛋白激酶通過對底物蛋白的磷酸化參與細胞信號轉導,是細胞信號轉導過程中起重要作用的

2、信號分子。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase,STPK)是其中最重要的一類蛋白激酶,可催化多種功能蛋白(如酶、受體、運輸?shù)鞍住⒄{節(jié)蛋白、核內蛋白等)的磷酸化,從而調節(jié)細胞多種生命活動過程。因此,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的研究對于闡明鹽藻復雜的耐鹽機制具有重要的科學意義。
　　本研究構建了原核表達載體pGS-21a-DsSTPK,真核表達載體pMDCSGN和pBI121-DsSTPK

3、,對已經獲得的鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因進行了原核表達和亞細胞定位的分析,為進一步研究STPK在鹽藻耐鹽過程中的作用及分子機制提供了新的信息。主要的實驗方法和結果如下:
　　1.應用PCR技術擴增了鹽藻DsSTPK基因,并將其克隆到pMDTM18-T Simple Vector上。DNA測序結果表明,該核苷酸序列未發(fā)生突變。利用限制性內切酶分別酶切克隆載體與表達載體,T4 DNA連接酶連接目的片段與載體大片段,成功構建了原核表

4、達載體pGS-21a-DsSTPK,真核表達載體pMDCSGN和pBI121-DsSTPK,經測序驗證讀碼框正確。
　　2.將原核表達載體 pGS-21a-DsSTPK導入E.coli.BL21(DE3)中,經IPTG誘導在E.coli BL21中得到成功表達。通過SDS-PAGE檢測,融合蛋白在上清和包涵體中均有存在。將上清蛋白經過GST標簽蛋白純化柱純化后獲得了純度較高的可溶性融合蛋白, Western blot顯示該融合蛋白