油茶FBPase基因和GAPDH基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及原核表達(dá)分析.pdf

1、油茶(Camellia oleifera)種子含油率較高,是我國(guó)南方重要的木本食用油料樹(shù)種。雖然目前已從油茶中分離出了一些基因,但還有大量基因未被分離鑒定出來(lái),難以滿足油茶的品種改良的要求。FBPase和GAPDH是光合作用暗反應(yīng)中非常重要的調(diào)控酶,克隆FBPase基因和GAPDH基因,解析FBPase基因和GAPDH基因的結(jié)構(gòu)和功能,研究FBPase和GAPDH的基因調(diào)控機(jī)制,有利于揭示油茶光合作用的過(guò)程和機(jī)理,為提高油茶的光能利用率

2、和油茶產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。為此,我們開(kāi)展了油茶FBPase和GAPDH的基因克隆、酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及活性、原核表達(dá)的研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶FBPase和GAPDH基因的全長(zhǎng)克隆。在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的油茶cDNA文庫(kù)和EST文庫(kù)的基礎(chǔ)上,利用專業(yè)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物,以油茶優(yōu)良無(wú)性系“湘林1號(hào)”的近成熟種子為材料,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板,采用5’RACE技術(shù)和3’RACE技術(shù)獲得

3、了FBPase基因和GAPDH基因的片段,將產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。通過(guò)網(wǎng)上BLAST比對(duì)測(cè)序結(jié)果,確認(rèn)其為油茶的FBPase基因和GAPDH基因的全長(zhǎng)cDNA序列,將該2個(gè)基因分別命名為CO-fbp和co-gapdh。其中,油茶FBPase基因的完整cDNA序列長(zhǎng)度為1356 bp,ORF為1023 bp:油茶GAPDH基因的完整cDNA序列長(zhǎng)度為1364 bp,ORF為1014 bp。<

4、br>　　 2.油茶FBPase和GAPDH的生物功能預(yù)測(cè)。應(yīng)用一系列生物信息學(xué)軟件分析結(jié)合在線軟件分析,結(jié)果表明:油茶FBPase蛋白分子量為37.7K Da,理論等電點(diǎn)為5.54,其中負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)目為44,正電荷氨基酸殘基數(shù)目為38,屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì),有三個(gè)比較明顯的跨膜區(qū),二級(jí)結(jié)構(gòu)分析其有12個(gè)α螺旋,其編碼蛋白不含二硫鍵,證明此油茶FBPase基因不受光調(diào)控,推測(cè)其為胞質(zhì)FBPase,其活性被AMP所抑制,最佳活性的pH為

5、8.0；油茶GAPDH基因編碼的蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為5.08,其分子式可寫成C3033H5054N1014O1282S216,油茶GAPDH蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì),不穩(wěn)定系數(shù)為44.50,該蛋白在大腸桿菌中半衰期大于10個(gè)小時(shí),脂肪系數(shù)為25.15,平均親水性0.692,該蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)域,二級(jí)結(jié)構(gòu)分析其有7個(gè)α螺旋。
　　 3.油茶FBPase和GAPDH基因的原核融合表達(dá)。分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異表達(dá)引物,選用限制性內(nèi)切酶Ndel和