家蠶Bax inhibitor-1基因的原核表達(dá)和功能分析.pdf

1、我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一條cDNA序列，在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果在序列和結(jié)構(gòu)上與其它物種的Ba.inlubtor-1基因具有較高的相似性，推測(cè)可能是家蠶Ba.inhibitor-1蛋白基因，我們把這一cDNA序列命名為BmBI-1(Bomby.ba.inhibitor-1)基因，GenBank登錄號(hào)為DN237509。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼235個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)是9.213，含有兩個(gè)

2、保守結(jié)構(gòu)域，分別是Ba.inhibitor-1-like家族和Ba.inhibitor-1-like超家族，跨膜結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)都表明該蛋白具有6個(gè)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，具有很強(qiáng)的疏水性，這一點(diǎn)從疏水性預(yù)測(cè)分析中也可以看出；功能預(yù)測(cè)表明，該蛋白很可能位于細(xì)胞內(nèi)膜上，作為通道蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡起重要的調(diào)節(jié)作用。在多序列比對(duì)中，我們發(fā)現(xiàn)該基因具有很高的保守性，特別是在跨膜區(qū)域與其他物種之間有很高的相似性，這可能是因?yàn)榭缒^(qū)域與該蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜上的

3、定位和通道的形成過程中起到關(guān)鍵的作用，并作為通道蛋白發(fā)揮作用。
　　 為了研究BmBI-1的功能，通過PCR的方法獲得了該基因的ORF，并克隆到載體pET-28a(+)中，成功重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-BmBI-1，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.col.BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用SDS-PAGE檢測(cè)，與陰性對(duì)照相比在29kDa處有一特異性條帶，與預(yù)期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達(dá)，通過分子篩和親和層析純化了重

4、組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價(jià)大于1：12800。用重組菌表達(dá)的總蛋白做Wester.blot檢測(cè)呈一條帶。利用多克隆抗體對(duì)家蠶細(xì)胞Bm5進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，初步確定BmBI-1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器上。
　　 同時(shí)，用熒光定量PCR和wester.blot的方法分析了不同組織及發(fā)育時(shí)期該基因的表達(dá)差異，定量?jī)?nèi)參選用18.rRNA，結(jié)果顯示在各組織中BmBI-1表達(dá)量從高到底依次是馬氏管、睪丸、頭、腸