外源性HMGB1對(duì)Lewis細(xì)胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的:
　　以Lewis肺癌細(xì)胞為靶向，探討高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)對(duì)癌細(xì)胞凋亡或增殖作用的影響，了解與其相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。
　　方法:
　　(1)細(xì)胞饑餓的誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的檢測(cè):饑餓緩沖液HBSS刺激Lewis細(xì)胞0、4、8、12h后采用Annexin(Ⅴ)/PI流式雙染及Hoechst33342染核檢測(cè)其凋亡情況。此外，1μg/ml、10μg

2、/ml外源性HMGB1蛋白作用于饑餓處理6h的Lewis細(xì)胞后同法檢測(cè)其凋亡率和存活率。
　　(2)促/抗凋亡蛋白的檢測(cè):10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于Lewis細(xì)胞0、12、24、36、48h后，在流式分析其凋亡百分比的同時(shí)，Western blot檢測(cè)促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量。
　　(3)RAGE和TLR-4受體檢測(cè):PCR檢測(cè)Lewis細(xì)胞HMGB1相關(guān)受體的基因，熒光顯微鏡進(jìn)一步觀察H

3、MGB1主要受體RAGE和TLR-4在Lewis細(xì)胞膜上的表達(dá)情況。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析外源性HMGB1蛋白作用后Lewis細(xì)胞RAGE和TLR-4表達(dá)量的變化。
　　(4)細(xì)胞增殖情況檢測(cè):10μg/ml HMGB1蛋白作用于Lewis細(xì)胞后，應(yīng)用MTT和CFSE法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，同時(shí)檢測(cè)加入RAGE和TLR-4抗體封閉細(xì)胞膜表面受體后細(xì)胞的增殖情況。Western blot進(jìn)一步分析PI3K/Akt及Erk1/2蛋白的表達(dá)，

4、并加入10μmol/L Erk1/2抑制劑U-0126后觀察其對(duì)Lewis細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)饑餓緩沖液HBSS作用于Lewis細(xì)胞0、4、8、12h后Annexin(Ⅴ)/PI流式雙染結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率隨著時(shí)間的增加而逐漸增多;Hoechst33342染核后熒光顯微鏡檢測(cè)的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加細(xì)胞體積變小，核碎裂，染色質(zhì)濃縮并且凋亡的細(xì)胞數(shù)也增多。1μg/ml、10μg/ml外源性HMGB1蛋白作

5、用于饑餓處理6h的Lewis細(xì)胞后，其凋亡率降低、存活率增加并且隨著濃度的加大變化更明顯。
　　(2)10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于未處理的Lewis細(xì)胞0、12、24、36、48h后其凋亡百分比降低，同時(shí)western blot結(jié)果顯示隨時(shí)間的增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)量減少，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。
　　(3)PCR結(jié)果表明，Lewis細(xì)胞存在HMGB1相關(guān)受體RAGE、TLR-2、TLR-4和

6、TLR-9;免疫熒光顯示，HMGB1主要受體RAGE和TLR-4均表達(dá)于Lewis細(xì)胞膜上，且加入外源性HMGB1作用后RAGE和TLR-4的表達(dá)量升高。
　　(4)MTT和CFSE結(jié)果都表明，10μg/ml外源性HMGB1蛋白能促進(jìn)Lewis細(xì)胞增殖，而RAGE和TLR-4抗體則對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。Western blot結(jié)果顯示，PI3K/Akt及Erk1/2蛋白活化，其磷酸化水平呈上升趨勢(shì)，而Erk1/2抑制劑U-0126