微小RNA在HMGB1介導小鼠脾臟樹突狀細胞免疫功能中的調(diào)控作用及其調(diào)節(jié)機制.pdf

1、目的:膿毒癥時高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為晚期炎癥介質(zhì)和損傷相關分子模式(DAMPs)的重要成員能誘導樹突狀細胞(DCs)免疫功能紊亂，但其分子調(diào)控機制仍不清楚。微小RNA(miRNAs，miR)對mRNA發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄后精細調(diào)控作用。本研究擬從miRNAs的角度探討HMGB1誘導DCs成熟活化的分子調(diào)控機制，旨在為進一步探索嚴重燒（創(chuàng)）傷后膿毒癥的免疫調(diào)控途徑提供新線索。
　　方法:第一部分，外源性HMGB1對小鼠脾臟DCs

2、細胞免疫功能的影響。參考本實驗室前期對大鼠脾臟DCs研究的基礎，用0、100、1000ng/ml三個濃度的重組HMGB1刺激正常小鼠脾臟DCs，48h后分別應用流式細胞術檢測DCs表面標志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHCⅡ)的表達情況;應用ELISA技術檢測DCs分泌細胞因子IL-12、TNF-α的水平;將HMGB1刺激48h后的DCs與脾臟T淋巴細胞按1∶100的比例共培養(yǎng)，于3天(d)后采用CCK-8試劑盒觀察T淋巴細胞對

3、絲裂原刺激的增殖反應，用ELISA技術檢測培養(yǎng)液中干擾素(IFN-γ)（判斷Th1/Th2功能分化）和IL-2（反映T細胞的分泌功能）的表達水平，最終確定HMGB1誘導DCs成熟活化的適合劑量。第二部分，HMGB1誘導小鼠脾臟DCs成熟活化后miRNA表達譜的研究。采用miRNAs芯片檢測經(jīng)HMGB1刺激活化后DCs中miRNAs表達譜的變化。結(jié)合芯片結(jié)果和文獻報道，鎖定可能發(fā)揮作用的差異表達miR:miR-181a-5p，通過RT-P

4、CR方法驗證該miR的表達量變化情況。第三部分，miR-181a-5p靶基因預測以及體外功能驗證實驗。運用計算機預測miR-181a-5p的靶mRNA，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實這一假設，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的mimics或inhibitor上調(diào)或下調(diào)細胞內(nèi)該miR表達量，用RT-PCR方法檢測其靶mRNA的表達量，從功能上驗證miR-181a-5p對靶mRNA的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:第一部分，與正常對照組(HMGB1濃度0

5、ng/ml組)相比，HMGB1(100ng/ml和1000ng/ml)作用48h后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達以及DCs分泌IL-12、TNF-α的水平均呈現(xiàn)雙向調(diào)控現(xiàn)象，即在HMGB1濃度為100ng/ml時上調(diào)顯著(P＜0.05或P＜0.001)，而HMGB1濃度為1000ng/ml時各指標反而有所下降，尤其是IL-12，分泌水平反而低于HMGB1(0ng/ml)組(P＜0.01);DCs與脾臟T淋巴細胞共培

6、養(yǎng)后，經(jīng)HMGB1刺激的DCs能顯著增強T淋巴細胞對絲裂原刺激的增殖反應(P＜0.01)，促進T細胞向Th1細胞極化[IFN-γ表達水平顯著增加(P＜0.01)]以及T細胞分泌功能增加[IL-2表達水平顯著升高(P＜0.01)]，且符合上述雙向調(diào)控現(xiàn)象，各指標在HMGB1（100ng/ml）組表達水平最高。通過本部分實驗我們確定了100ng/ml為誘導DCs成熟活化的適合劑量。第二部分，100ng/mlHMGB1刺激DCs后用miRNA

7、s芯片篩選出14個差異表達miRNAs，結(jié)合文獻推測上調(diào)的miR-181a-5p(P＜0.05)可能與HMGB1誘導的DCs免疫功能紊亂密切相關。運用RT-PCR技術驗證了其上調(diào)趨勢(P＜0.01)和芯片結(jié)果一致，且也存在HMGB1的雙向調(diào)控現(xiàn)象。第三部分，通過計算機預測TNF-α3'untranslated region(UTR)可能存在miR-181a-5p的靶基因位點，于是構(gòu)建包含預測靶位點的TNF-α野生型(WT)和TNF-α突

8、變型(MUT)載體進行熒光素酶實驗，結(jié)果顯示:與對照組相比較，miR-181a-5p能使WT組載體的熒光強度顯著下降(P＜0.001)。此外，我們對DCs轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后，發(fā)現(xiàn)DCs內(nèi)TNF-αmRNA的表達量下調(diào)顯著(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitors后則顯著增強其TNF-αmRNA的表達(P＜0.001)。
　　結(jié)論:通過本項研究，我們證實了外源性HMGB1對小鼠脾臟D