RGDyC與TAT肽修飾的雙功能樹枝狀聚合物納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及評(píng)價(jià).pdf

1、血管新生是許多疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，目前發(fā)現(xiàn)與血管生成相關(guān)的疾病有70多種，如腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬等。血管新生是引起現(xiàn)代疾病的無(wú)形殺手。目前臨床上針對(duì)該類疾病的治療手段尚存在不足之處，如藥物普遍選擇性低、毒副作用大、患者順應(yīng)性差等，限制了治療效果。因此，為了提高新生血管疾病的治療效果與改善患者順應(yīng)性，迫切需要尋求更加安全、有效的治療手段。近年來(lái)通過(guò)全身給藥的靶向納米遞藥系統(tǒng)的研究為新生

2、血管疾病的診斷和治療提供了新方向。
　　本課題以增加遞藥系統(tǒng)對(duì)新生血管疾病部位的靶向性和穿透能力為目的，用與新生血管高表達(dá)的整合素αvβ3受體具有特異性親和力的RGDyC肽和具有細(xì)胞穿透作用的TAT肽共同修飾樹枝狀聚合物聚酰胺-胺（Polyamidoamine, PAMAM）構(gòu)建具有靶向性與穿透性的雙功能樹枝狀聚合物PAMAM-PEGn-RGDyC(TAT)(PPnR(T))。以該雙功能樹枝狀聚合物作為靶向治療血管新生疾病的藥物載

3、體，以姜黃素(Curcumin, Cur)為藥物模型，整合素αvβ3受體為作用靶點(diǎn)，構(gòu)建PPnR(T)/Cur載藥納米復(fù)合物，對(duì)雙功能載體的靶向性和穿透性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以探討 PPnR(T)作為靶向治療血管新生疾病藥物載體的可行性與有效性。本文主要從以下章節(jié)進(jìn)行研究：
　　1. RGDyC肽與TAT肽修飾的樹枝狀聚合物PPnR(T)的合成。
　　以PAMAM為合成載體核心，表面氨基借助MAL-PEG-NHS與RGDyC及TAT偶

4、聯(lián)，以羅丹明B異硫氫酸酯(Rhodamine B Isothicyanate, RBITC)為熒光探針，制備載體PPnR(T)及RB-PAMAM、PAMAM-PEGn(PPn)、PAMAM-PEGn- RGDyC(PPnR)，其中n（n=5、15、30）為MAL-PEG-NHS與PAMAM的投料摩爾比。通過(guò)1H NMR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)并計(jì)算每個(gè)PAMAM分子表面所連接的 PEG、RGDyC、TAT數(shù)量分別為25.4、10.9、2.6（n=30）

5、，動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測(cè)定粒徑為(13.95?0.33) nm，Zeta電位為(3.35?0.87) mV。
　　2.納米載體PPnR(T)的細(xì)胞水平評(píng)價(jià)。
　　采用MTT法考察合成載體對(duì)293T細(xì)胞(αvβ3-)與HUVECs(αvβ3+)的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明PPnR(T)對(duì)293T細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，對(duì)HUVECs的細(xì)胞毒性較大，且細(xì)胞毒性隨PEG化程度的增大而降低；用流式細(xì)胞分選儀檢測(cè)細(xì)胞攝取效率，結(jié)果表明，當(dāng)n=30時(shí)，

6、PPnR(T)在RGDyC與TAT的協(xié)同作用下對(duì)HUVECs表現(xiàn)出最優(yōu)的靶向性和穿透性，且被 HUVECs攝取的過(guò)程主要與特異性的 RGD-整合素αvβ3受體相互作用及非特異性的靜電相互作用有關(guān)，激光共聚焦顯微鏡觀察到PP30R(T)被細(xì)胞攝取后分布于細(xì)胞質(zhì)；PP30R(T)對(duì)體外多細(xì)胞腫瘤球具有較好的滲透效應(yīng)。
　　3.納米載體PPnR(T)的動(dòng)物水平評(píng)價(jià)。
　　建立MCF-7細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，用合成的PP30R(T)包載

7、熒光染料DiR以示蹤納米載體在體內(nèi)的分布，通過(guò)小動(dòng)物活體成像對(duì)PP30R(T)在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明PP30R(T)在腫瘤部位的積聚高于PP30、PP30R，在體內(nèi)顯示出較好的腫瘤新生血管靶向性與膜穿透性，體外器官成像結(jié)果表明，PP30R(T)/DiR組腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度是PP30/DiR組的2.8倍，是PP30R/DiR的1.5倍。
　　4.物理包埋法制備PP30R(T)/Cur復(fù)合物納米遞藥系統(tǒng)并表征。

8、>　　Cur通過(guò)物理包埋法進(jìn)入PAMAM疏水空腔。姜黃素載藥納米復(fù)合物的粒徑為(72±11)nm，載藥量為9.76％。采用透析袋法，以 pH7.4的PBS緩沖液添加0.5%的吐溫80作為釋放介質(zhì)進(jìn)行藥物的體外釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，PP30R(T)/Cur在72 h內(nèi)累積釋放72.1%，已基本釋放完全，而且PP30R(T)/Cur提高了Cur的穩(wěn)定性。
　　5. PP30R(T)/Cur復(fù)合物納米遞藥系統(tǒng)的靶向性評(píng)價(jià)。
　　利用

9、熒光顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞(αvβ3-)與HUVECs(αvβ3+)對(duì)PP30R(T)/Cur納米復(fù)合物的攝取情況，結(jié)果表明，整合素αvβ3受體過(guò)表達(dá)的HUVECs對(duì)PP30R(T)/Cur的攝取效率高于PP30/Cur與PP30R/Cur復(fù)合物；MTT法測(cè)得PP30R(T)/Cur復(fù)合物對(duì)HUVECs的細(xì)胞毒性強(qiáng)于PP30/Cur與PP30R/Cur組。
　　6. PP30R(T)/Cur復(fù)合物納米遞藥系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。<