促甲狀腺激素與脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的相關(guān)性研究.pdf

1、論文一TSH與大鼠胰島素抵抗及脂肪組織GLUT4達(dá)關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　近年來，關(guān)于促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)與肥胖、代謝綜合征的相關(guān)研究成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，即使甲狀腺功能在正常范圍內(nèi)，血清TSH水平與體重指數(shù)(body mass index，BMI)、胰島素抵抗程度均呈顯著正相關(guān)，與胰島素敏感性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。然而，TSH引起胰島素抵抗的具體機(jī)制尚

2、未明確，需要進(jìn)一步研究。
　　脂肪組織是胰島素的主要外周靶組織。胰島素靶細(xì)胞的糖攝取主要是依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter4，GLUT4）實(shí)現(xiàn)的，GLUT4特異性表達(dá)于胰島素敏感的脂肪細(xì)胞及骨骼肌中，基礎(chǔ)狀態(tài)下大部分儲(chǔ)存于胞內(nèi)囊泡中，胰島素刺激后可使其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，同時(shí)糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)，攝取血液中的葡萄糖以維持血糖的穩(wěn)定。胰島素抵抗與GLUT4的表達(dá)量及胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)量減少有關(guān)，甲減或亞臨床甲減人群的胰

3、島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulinresistance index，HOMA-IR)升高，但是尚無TSH升高與GLUT4表達(dá)關(guān)系的研究報(bào)道。
　　本研究擬建立亞臨床甲減、臨床甲減、高脂飲食肥胖大鼠模型，應(yīng)用高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)及HOMA-IR指數(shù)評(píng)價(jià)大鼠胰島素抵抗程度，并檢測(cè)內(nèi)臟及皮下脂肪組織GLUT4mRNA與蛋白的表達(dá)水平。探討TSH水平升高對(duì)胰島素抵抗和GLUT4表達(dá)

4、的影響。
　　方法:
　　將48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成4組(n=12):完全甲減組(clinicalhypothyroidism，CH):手術(shù)完全切除甲狀腺，術(shù)后一個(gè)月開始于頸背部皮下注射等體積0.9％的氯化鈉溶液。亞臨床甲減組(subclinical hypothyroidism，SCH):手術(shù)切除甲狀腺，術(shù)后一個(gè)月開始于頸背部皮下注射L-T4溶液0.95μg/(100g·d)建立亞臨床甲減模型。高脂肥胖組(HF)

5、:給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方20％豬油、5％蔗糖、5％蛋黃粉、2％膽固醇、0.5％膽酸鈉、67.5％普通飼料。正常對(duì)照組(NC):行甲狀腺切除假手術(shù)，術(shù)后一個(gè)月開始于皮下注射等體積0.9％的氯化鈉溶液，作為陰性對(duì)照。術(shù)后自注射藥物8周后，眶后靜脈采血測(cè)定甲功、血脂、空腹血胰島素，行麻醉狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn);留取附睪周圍內(nèi)臟脂肪組織和腹股溝皮下脂肪組織，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)臟和皮下脂肪GLUT4、腫瘤壞

6、死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)、胰島素受體底物-1(insulin receptorsubstrate-1，IRS-1)mRNA的表達(dá)水平，應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)上述指標(biāo)蛋白水平的表達(dá)。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后4周CH組

7、與SCH組大鼠的體重均明顯低于NC組與HF組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)HF組大鼠體重最重（657.2±29.7g），CH組體重最低(331.3±57.0g)，SCH組大鼠體重(445.1±42.7g)雖較CH組大鼠有明顯的增加(P＜0.05)，但仍較NC組（546.7±64.2g）及HF組的體重明顯降低(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)眶后靜脈采血測(cè)定TSH及TT4，顯示TSH值CH組（17.89±5.3mIU/L）和SCH組（3.57±0

8、.38mIU/L）較NC組（0.47±0.08 mIU/L）、HF組（0.33±0.05 mIU/L）均明顯升高(P＜0.05);而CH組TT4（1.41±0.42μg/dl）較其他三組均明顯降低(P＜0.05)，SCH組TT4（5.63±0.56μg/dl）與NC組（5.49±0.72μg/dl）、HF組（6.18±0.88μg/dl）無明顯差異，模型制備成功。
　　2.CH組、SCH組和HF組大鼠的鉗夾實(shí)驗(yàn)60～120min的

9、平均葡萄糖輸注率（glucose infusion rate，GIR60-120）較NC組明顯下降(P＜0.05)，CH組GIR60-120明顯低于SCH組(P＜0.05);而此三組的HOMA-IR也比NC組的明顯升高(P＜0.05)，均以HF組最明顯，CH組與SCH組無明顯差異。表明甲減和亞臨床甲減大鼠均存在一定程度的胰島素抵抗。
　　3.GLUT4和其他相關(guān)因子在大鼠附睪周圍內(nèi)臟脂肪和腹股溝皮下脂肪的表達(dá)水平和變化趨勢(shì)基本一致

10、。結(jié)果顯示，CH組、SCH組和HF組大鼠脂肪組織GLUT4和IRS-1 mRNA的表達(dá)均較NC組的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，TNF-αmRNA的表達(dá)均較NC組明顯上調(diào)（P＜0.05），且以HF組的下調(diào)或上調(diào)更為顯著。四組之間TSHR mRNA的表達(dá)無明顯差異。Western blotting檢測(cè)脂肪組織蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，CH組和SCH組大鼠脂肪組織GLUT4蛋白表達(dá)均較NC組表達(dá)下降(P＜0.05);HF組、CH組和SCH組TNF

11、-α蛋白表達(dá)均較NC組表達(dá)升高(P＜0.05); HF組、CH組和SCH組大鼠附睪周圍內(nèi)臟脂肪p-IRS-1(ser307)蛋白表達(dá)較NC組明顯升高(P＜0.05)，且以CH組升高最為明顯;CH組大鼠皮下脂肪組織p-IRS-1(ser307)蛋白表達(dá)較NC組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.TSH水平升高并未改變大鼠脂肪組織的TSHR表達(dá)。
　　2.TSH水平升高會(huì)加重大鼠胰島素抵抗，可能部分是通過上調(diào)脂

12、肪組織TNF-α表達(dá)、下調(diào)GLUT4表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　論文二TSH對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取及TNF-α達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，血清促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)水平升高與胰島素抵抗顯著正相關(guān)。本課題動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲減與亞臨床甲減大鼠的胰島素抵抗明顯加重，而且胰島素抵抗的主要外周靶組織脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter

13、4，GLUT4)表達(dá)下調(diào)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)表達(dá)上調(diào)，這些變化是否與體內(nèi)升高的TSH水平有關(guān)系需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　本研究擬培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，應(yīng)用TSH刺激分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，觀察TSH對(duì)其葡萄糖攝取和GLUT4表達(dá)的影響;同時(shí)研究TSH對(duì)細(xì)胞分泌TNF-α的影響及促進(jìn)其分泌的可能信號(hào)通路。
　　方法:
　　誘導(dǎo)分化3T3-L1脂

14、肪細(xì)胞8～10天，應(yīng)用油紅O染色鑒定分化程度。對(duì)分化成熟的脂肪細(xì)胞應(yīng)用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基過夜，給予不同濃度(0、0.1mIU/ml、1 mIU/ml、10mIU/ml)的TSH刺激48h，分別采用2-脫氧-3H-D-葡萄糖攝入法檢測(cè)葡萄糖攝取量和氧化酶法葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基葡萄糖消耗量;給予濃度0.1 mIU/ml TSH孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，或者給予不同濃度的TSH（0，0.01 mIU/ml，

15、0.1 mIU/ml，1mIU/ml，10 mIU/ml）孵育細(xì)胞4h，收集細(xì)胞上清和沉淀，ELISA方法檢測(cè)上清中TNF-α的濃度，Real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)。給予不同濃度(0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml)的TSH刺激48h，檢測(cè)細(xì)胞GLUT4 mRNA及蛋白水平的表達(dá);另設(shè)一組細(xì)胞應(yīng)用TNF-α拮抗劑Rapamycin(20nmol/L)預(yù)處理1h后予TSH(1

16、mIU/ml)刺激48h，收集細(xì)胞測(cè)定GLUT4 mRNA及蛋白水平。分組加藥刺激，分別予磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3-K)抑制劑Wortmannin(10-6mol/L)干預(yù)30分鐘、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，P38MAPK)抑制劑SB203580（10-5mol/L）干預(yù)30分鐘、蛋白激酶A抑制劑H89(0.01mmo

17、l/L)干預(yù)15分鐘，其后三組細(xì)胞予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和單純TSH(1mIU/ml)干預(yù)組，Western blotting技術(shù)測(cè)定細(xì)胞TNF-α蛋白水平的表達(dá)。細(xì)胞爬片鋪板，誘導(dǎo)分化成熟后，H89（0.01mmol/L）干預(yù)15分鐘，其后予或不予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和單純TSH(1mIU/ml)干預(yù)組，進(jìn)行GLUT4免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡拍照比較GLUT4表

18、達(dá)強(qiáng)弱。
　　結(jié)果:
　　3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化10天，油紅O染色細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多亮紅色顆粒，證實(shí)誘導(dǎo)分化成功。胰島素刺激的細(xì)胞葡萄糖攝取被認(rèn)為是測(cè)定胰島素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)，每分鐘的衰變數(shù)(decay per minute，DPM)越高提示脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取量越多，有胰島素刺激時(shí)，DPM值明顯升高。隨著TSH刺激濃度的增加，顯示3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取量逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 vs基線）。

19、而且，TSH會(huì)降低3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P＜0.05 vs基線)，抑制效應(yīng)與TSH濃度呈正相關(guān)。
　　3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞在0.1 mIU/ml TSH刺激后，細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)及培養(yǎng)基中TNF-α濃度明顯上調(diào)，與基線水平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.001)，并于刺激4h達(dá)峰值。與空白對(duì)照組相比，隨著TSH濃度的增加，TNF-α mRNA的表達(dá)和培養(yǎng)基中TNF-α的濃度呈上升趨勢(shì)，差異

20、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.001)。
　　不同濃度TSH（0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml）刺激3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞48h。與空白對(duì)照組相比，隨著TSH濃度的增加GLUT4 mRNA和總蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.001 vs基線);予TNF-α的拮抗劑Rapamycin預(yù)處理1h，再予TSH1 mIU/ml刺激48h后，Rapamycin可以逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，且與空白對(duì)照組相比差異無

21、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　應(yīng)用三種信號(hào)通路抑制劑作用3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞后，再予TSH刺激細(xì)胞48h，結(jié)果顯示H89明顯地抑制TNF-α蛋白的表達(dá)(P＜0.001)，而Wortmannin和SB203580未能夠抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示，單純應(yīng)用TSH刺激后，GLUT4的熒光強(qiáng)度較空白對(duì)照組明顯減弱;而給予H89刺激后，應(yīng)用或不應(yīng)用TSH刺激48h，GLUT4的熒光強(qiáng)度均較單純應(yīng)用TSH刺激48h的有

22、所增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.TSH能降低3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取量及培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量，增加脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗程度。
　　2.TSH可以通過增加TNF-α的表達(dá)來下調(diào)GLUT4的表達(dá)，且TSH可以部分通過蛋白激酶A途徑促進(jìn)TNF-α的表達(dá)。
　　論文三不同腰圍切點(diǎn)值對(duì)評(píng)估中國(guó)成人代謝綜合征患病率和危險(xiǎn)因素的影響
　　隨著中國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，中國(guó)人的生活方式有了很大改變，導(dǎo)致超重與肥胖患病

23、率的快速升高。截止到2008年底，全世界超重及肥胖癥患者已達(dá)15億，其中20％是中國(guó)人。超重和肥胖是代謝綜合征(metabolic syndrome，MetS)的核心組份，而MetS是心血管疾病(cardivascular disease，CVD)和糖尿病的主要危險(xiǎn)因素。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)提出的MetS診斷標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)了中心性肥胖是診斷MetS的先決條件而且可將腰圍測(cè)定作為一個(gè)簡(jiǎn)單的篩查工具，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了腰圍的種族差異。對(duì)亞裔成年人，

24、除日本以外，IDF將中心性肥胖腰圍切點(diǎn)定義為男性≥90cm，女性≥80cm。
　　然而上述腰圍切點(diǎn)并不太適用于中國(guó)成年女性，多項(xiàng)研究成果建議將中國(guó)成人腹型肥胖的最佳腰圍切點(diǎn)分別設(shè)為男性≥90cm，女性≥85cm。本研究小組應(yīng)用此腰圍切點(diǎn)及中國(guó)成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(huì)(JCDCG)提出的MetS標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行橫斷面流行病學(xué)調(diào)查。研究人群來自2007～2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)組織的中國(guó)糖尿病和代謝性疾病研究。
　　方

25、法:
　　由中國(guó)糖尿病和代謝性疾病研究小組應(yīng)用多級(jí)分層、整群抽樣方法在全國(guó)14個(gè)省、市及自治區(qū)進(jìn)行了此項(xiàng)橫斷面調(diào)查研究。共有45157名20～74歲的中國(guó)居民參與調(diào)查，參與調(diào)查者需完成一份調(diào)查問卷，收集臨床資料包括人口學(xué)基本特征、個(gè)人史、家族史、生活方式危險(xiǎn)因素如吸煙和飲酒等。調(diào)查內(nèi)容也包括既往高血壓病、糖尿病、脂代謝紊亂和其他慢性疾病的診斷與治療情況。按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行體格檢查，采集被調(diào)查者的身高、體重、腰圍和血壓;并抽取靜脈血檢

26、測(cè)空腹血糖、血脂及759糖負(fù)荷后30min、120min的靜脈血糖。分別應(yīng)用國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的標(biāo)準(zhǔn)和修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)定義MetS，分析比較兩種標(biāo)準(zhǔn)下不同腰圍切點(diǎn)對(duì)MetS患病率和相關(guān)危險(xiǎn)因素的影響。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)年齡標(biāo)化的MetS患病率分別為24.2％(IDF)和19.5％（修訂版IDF），而代謝綜合征前期的患病率為8.1％。按照這兩個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)，代謝綜合征的患病率隨著年齡增加有明顯的升高，且女性較男性的升高趨勢(shì)

27、更明顯。
　　三個(gè)不同經(jīng)濟(jì)水平地區(qū)的農(nóng)村居民MetS患病率明顯低于城鎮(zhèn)居民(IDF標(biāo)準(zhǔn)，22.1％ vs.26.5％，P＜0.001;修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)，17.7％ vs.21.3％，P＜0.001)。以秦嶺-淮河一線為界劃分中國(guó)南北地域，北方MetS患病率較南方明顯升高(IDF標(biāo)準(zhǔn)，28.0％ vs.19.7％，P＜0.001;修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)，23.1％ vs.14.7％，P＜0.001)。按性別分層，不論農(nóng)村還是城鎮(zhèn)地區(qū)，不論

28、南方還是北方地區(qū)，女性MetS的患病率修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)明顯低于IDF標(biāo)準(zhǔn)(P＜0.001)。
　　20～74歲男性中心性肥胖的患病率達(dá)到35.1％，女性中心性肥胖的患病率分別是47.5％(IDF標(biāo)準(zhǔn))和29.7％（修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)）;就代謝綜合征單一組份而言，血壓升高或者高血壓的患病率是最高的，男性高達(dá)65.4％，女性達(dá)到53.0％(IDF)和58.9％（修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)）;除女性低水平的HDL-C這一組份之外，另三項(xiàng)組份患病率在

29、中心性肥胖者中IDF標(biāo)準(zhǔn)低于修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)（P均＜0.001）。超過40％的肥胖男性和超過30％的肥胖女性有兩項(xiàng)代謝綜合征異常組份。對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)定義的女性中心性肥胖者中擁有兩項(xiàng)及兩項(xiàng)以上代謝綜合征異常組份的患病率，修訂版IDF標(biāo)準(zhǔn)定義的明顯偏高(P＜0.05)。
　　多元回歸分析證實(shí)，許多危險(xiǎn)因素包括年齡、城鎮(zhèn)居住、較高的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、當(dāng)前吸煙、酒精攝入、糖尿病家族史、高血壓家族史和肥胖家族史均與代謝綜合征有明顯相關(guān)性，文化水平則