CD40L與胰島素抵抗相關(guān)性研究.pdf

1、代謝綜合征是一類集中心性肥胖，糖、脂代謝紊亂，高血壓等多種代謝異常于一身的臨床綜合征。慢性炎癥、血小板活化、血管內(nèi)皮損傷也是代謝綜合征的組成成分。目前普遍認(rèn)為胰島素抵抗是代謝綜合征發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。胰島素抵抗可以導(dǎo)致血小板活化、血管內(nèi)皮損傷、血栓形成，從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生。 CD40L（CD40 ligand）是一種分子量為39KD的II型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子基因超家族成員。是新興的研究慢性炎癥、血小板活化的指標(biāo)。

2、 既往對于胰島素抵抗與CD40L的研究大多是橫斷面調(diào)查，并沒有進(jìn)一步行干預(yù)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)兩者之間的關(guān)系。故設(shè)想在本次試驗(yàn)中不僅觀測胰島素抵抗動(dòng)物模型中的CD40L的變化。并通過羅格列酮干預(yù)治療，改善胰島素抵抗后，觀測CD40L變化，進(jìn)一步說明胰島素抵抗和CD40L的關(guān)系。有望使CD40L成為新的反映胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下慢性炎癥、血小板活化的觀測指標(biāo)。 本文將分三部分對上述問題進(jìn)行闡述： 第一部分： 胰島素抵抗大鼠模型的建立：

3、 目的： 通過高脂、高熱量飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)腹型肥胖、高甘油三酯血癥、高胰島素血癥，從而成功建立胰島素抵抗動(dòng)物模型。 方法： 健康SD 6周齡大鼠60只，按體重隨機(jī)分為普食組（C，n=15）、高脂組（HF，n=45）。C組喂以基礎(chǔ)飼料，HF組喂以高脂飼料。0周時(shí)測定空腹血糖、空腹胰島素、體重、HOMA-IR、血脂。高脂喂養(yǎng)8周后每4周檢測一次。第12周復(fù)測空腹血糖、空腹胰島素、體重、HOMA-IR、血脂。

4、部分大鼠行OGTT、IRT、ITT評估胰島素抵抗。處死部分大鼠（C組5只，HF組6只，共11只），稱量腹內(nèi)脂肪重量，計(jì)算體脂比。 結(jié)果： 一 各組生化指標(biāo)比較 0周時(shí)兩組體重、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR、甘油三酯、膽固醇差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至8周時(shí)高脂組體重高于普食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）12周時(shí)除體重外，HOMA-IR、膽固醇、甘油三酯兩組間也出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。部分大鼠體脂比，

5、高脂組高于普食組（P<0.05）。血糖、胰島素兩組間差異未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 二 胰島素抵抗評估： 口服糖耐量及胰島素釋放試驗(yàn)：高脂組AUC（OGTT）、AUC（IRT）均較普食組升高（P<0.05），且糖負(fù)荷后60、120分鐘血糖，30、60分鐘胰島素也高于普食組（P<0.05）。 胰島素耐量試驗(yàn)：注射胰島素后高脂組大鼠血糖下降緩慢，40、90分鐘血糖高于普食組（P<0.05）。曲線下面積增大（P

6、<0.05）。 三 HOMA-IR相關(guān)性分析： spearman相關(guān)分析顯示：HOMA-IR除與空腹血糖、胰島素相關(guān)外尚與體重（r=0.31462，P<0.05）、甘油三酯相關(guān)（r=0.33643，P<0.05）。 結(jié)論： 使用高脂飼料經(jīng)過12周喂養(yǎng)后誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)HOMA-IR升高、糖耐量下降、胰島素敏感性下降。并伴有肥胖（尤其是中心性肥胖）及高甘油三酯血癥。成功建立了胰島素抵抗動(dòng)物模型。 第二部

7、分：CD40L在胰島素抵抗大鼠中的表達(dá) 目的： 在胰島素抵抗大鼠模型中觀察CD40L的表達(dá)水平，并研究影響CD40L表達(dá)的相關(guān)因素。 方法： 健康SD 6周齡大鼠60只，按體重隨機(jī)分為普食組（C）、高脂組（HF）。C組喂以基礎(chǔ)飼料，HF組喂以高脂飼料。第12周胰島素抵抗動(dòng)物模型建立后。以ELISA法測定循環(huán)sCD40L濃度。處死部分大鼠（C組5只，HF組6只，共11只），腹主動(dòng)脈采血，以免疫沉淀、免疫印跡

8、測定血小板膜蛋白CD40L表達(dá)。取腹主動(dòng)脈免疫組化檢測CD40L在主動(dòng)脈上的表達(dá)。 結(jié)果： 循環(huán)sCD40L水平在高脂組明顯高于普食組（P=0.0001）。血小板膜蛋白CD40L經(jīng)免疫沉淀、免疫印跡顯示在39KD處見一蛋白條帶。免疫組化顯示CD40L主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上。高脂組CD40L陽性面積百分比高于普食組（P=0.0282）。相關(guān)分析顯示：sCD40L 與體重相關(guān)（r=0.44355，P=0.004

9、1）。 結(jié)論： 胰島素抵抗大鼠CD40L明顯升高，CD40L水平與肥胖相關(guān)。 第三部分：羅格列酮對胰島素抵抗CD40L表達(dá)的影響 目的： 通過羅格列酮干預(yù)改善胰島素抵抗，觀察胰島素抵抗轉(zhuǎn)歸過程中CD40L的變化，探討胰島素抵抗、CD40L之間的關(guān)系。 方法： 胰島素抵抗大鼠模型建立后，高脂喂養(yǎng)大鼠隨機(jī)分為：高脂對照組（HF，n=13）、小劑量羅格列酮治療組（L，n=13）、大劑量羅

10、格列酮治療組（H，n=13）。普食組（C，n=10）。小劑量干預(yù)組每天給予羅格列酮5mg/kg，大劑量干預(yù)組每天給予羅格列酮10mg/kg灌胃。高脂對照組及普食組給予相應(yīng)生理鹽水灌胃。 干預(yù)治療4周復(fù)測各大鼠體重、甘油三酯、膽固醇、血糖、胰島素、HOMA-IR、胰島素耐量、糖耐量、胰島素釋放，以及循環(huán)sCD40L、血小板膜蛋白CD40L表達(dá)水平。處死大鼠，分離腹主動(dòng)脈，免疫組化測定主動(dòng)脈上CD40L的表達(dá)。并測量體脂比。

11、結(jié)果： 一 各組生化指標(biāo)比較： 羅格列酮干預(yù)4周后，大劑量治療組血糖低于高脂組（P<0.05），胰島素、HOMA-IR不僅低于高脂組也低于小劑量治療組（P<0.05）。但小劑量組血糖、胰島素、HOMA-IR與高脂組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩干預(yù)組體重、體脂比與高脂組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二 胰島素抵抗評估： 1. 口服糖耐量試驗(yàn)： 羅格列酮干預(yù)4周后大劑量干預(yù)組空腹、120分鐘血糖均較高脂組低（P

12、<0.05），小劑量組空腹血糖與高脂組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但120分鐘血糖低于高脂組（P<0.05）。曲線下面積兩治療組均較高脂組降低（P<0.05）。 2. 胰島素釋放試驗(yàn)： 羅格列酮干預(yù)4周后大劑量干預(yù)組空腹胰島素較高脂組低（P<0.05）。小劑量干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)胰島素與高脂組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。曲線下面積大劑量干預(yù)組低于高脂組（P<0.05）。 3. 胰島素耐量試驗(yàn)： 羅格列酮干預(yù)4周后在各組空腹血糖無

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下。大劑量干預(yù)組40、90、120分鐘血糖低于高脂組（P<0.05）。小劑量治療組僅90分鐘血糖低于高脂組（P<0.05）。兩干預(yù)組曲線下面積較高脂組減?。≒<0.05）。 三 各組CD40L表達(dá)水平： 1. 循環(huán)sCD40L水平： 羅格列酮干預(yù)后大劑量治療組sCD40L水平明顯低于高脂組（P<0.05）。小劑量治療組與高脂組相比無明顯差異（P>0.05）。 2. 血小板膜蛋白CD40L表

14、達(dá)水平： 高脂組CD40L表達(dá)高于普食組（2.08±0.40 vs 1.44±0.21，P<0.05)。大劑量干預(yù)組CD40L表達(dá)明顯低于高脂組(1.41±0.27 vs 2.08±0.40，P<0.050)。小劑量干預(yù)組CD40L表達(dá)與高脂組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.93±0.33 vs 2.08±0.40，P>0.05）。 3. CD40L在主動(dòng)脈上的表達(dá)： CD40L主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。陽性面積

15、百分比顯示大劑量治療組較高脂組明顯下降（P<0.05），小劑量治療組與高脂組無明顯差異。 4. sCD40L相關(guān)性檢驗(yàn)： 羅格列酮干預(yù)后spearman相關(guān)檢驗(yàn)顯示sCD40L不僅與體重、體脂比、甘油三酯相關(guān)，而且與AUC（ITT）、AUC（OGTT）相關(guān)。 結(jié)論： 本試驗(yàn)在羅格列酮治療4周后，大劑量治療組空腹胰島素、HOMA-IR明顯下降，同時(shí)改善了受損的糖耐量及胰島素敏感性。在胰島素抵抗得到改善的同時(shí)

16、，大劑量治療組sCD40L水平較高脂組明顯降低，也低于干預(yù)前水平（P=0.0031）。說明sCD40L隨著胰島素抵抗的改善而下降。 在引入AUC（ITT）、AUC（OGTT）這兩個(gè)代表胰島素敏感性及糖耐量損傷程度的指標(biāo)后，spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)顯示sCD40L水平不僅與肥胖、高甘油三酯血癥相關(guān)，也與胰島素敏感性及糖耐量損傷相關(guān)。 小結(jié)： 1. 使用高脂飼料經(jīng)過12周喂養(yǎng)后誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)HOM