膠質(zhì)瘤氬氦凍融產(chǎn)物負載樹突狀細胞介導大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的免疫治療研究.pdf

1、研究背景:
　　 膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其在顱腦腫瘤中所占的比例高達44.69％。近幾十年來在膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域各國均進行了深入研究，治療的主流手段仍為手術(shù)，化療和放射治療。盡管部分患者能通過這些療法有一定緩解，但從總體情況看膠質(zhì)瘤的治愈率仍較低，復發(fā)率高，預后極差，中位生存約14個月。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，常規(guī)手術(shù)很難找到其明顯邊界，術(shù)后復發(fā)率很高;大部分腦膠質(zhì)瘤細胞對放療、化療不敏感，手術(shù)創(chuàng)傷及放化療對機體免疫力又產(chǎn)生

2、抑制和破壞。
　　 氬氦冷凍治療技術(shù)是近年源自美國氬氦冷凍治療設備而興起的一種低溫冷凍技術(shù)。利用高科技手段和航天材料制成的帶有微細刀頭的氬氦冷凍設備，可在計算機的控制下，利用冷熱逆轉(zhuǎn)的原理，達到破壞腫瘤的作用。即高壓氬氣經(jīng)過冷凍刀傳導，短時間內(nèi)(10～20秒)在刀尖部位形成-140℃的超低溫，形成似梭形冰塊冷凍組織，腫瘤細胞瞬間形成冰晶體而死亡。復溫時，高壓氦氣達到刀頭時迅速升至45℃，腫瘤細胞內(nèi)的冰晶體在這一溫度下快速解凍而導

3、致細胞裂解，對腫瘤細胞產(chǎn)生二次攻擊，達到徹底破壞腫瘤組織的作用，而整個過程刀桿基本保持常溫。由于操作簡單、安全，對病人創(chuàng)傷小，此項治療技術(shù)發(fā)展迅速，已應用于臨床各組腫瘤疾病，包括肝、腎、胰腺癌、前列腺痛和肺癌各種組織，是很有前途的技術(shù)。近幾年國內(nèi)外大量基礎和臨床研究發(fā)現(xiàn)冷凍治療技術(shù)不僅能直接殺傷腫瘤，其冷凍后的腫瘤細胞能作為抗原增強術(shù)后抗腫瘤免疫能力，引發(fā)繼發(fā)性的冷凍免疫反應。近來的研究表明，這一機制與抗原遞呈細胞（Antigenpre

4、sentingcells，APC）有關(guān)。目前認為，腫瘤經(jīng)冷凍破壞后，細胞膜融解破裂，從而促使細胞內(nèi)和處于遮蔽狀態(tài)的抗原釋放，抗原遞呈細胞(APC)通過識別、加工、處理腫瘤抗原并將其信息提供給T細胞，發(fā)生冷凍免疫效應。
　　 樹突狀細胞(dendriticcells，DC)是目前所知體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細胞(APC)，具有攝取、處理抗原的能力，如腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)性抗原及完全性細胞抗原。經(jīng)過修飾的DC通過把抗原加工成肽，載

5、入第二類主要組織相容性復合（MHCClassⅡ）分子運送到細胞表面，依賴于共刺激信號和T細胞受體(TCR)抗原的識別，如T細胞上的CD28識別DC上的B7.1(CD80)分子或B7.2(CD86)分子，激活特異性T細胞，激發(fā)初次細胞免疫應答。同時成熟DC分泌的白細胞介素（如白介素12，IL-12）等免疫因子，通過誘導T細胞分化為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，調(diào)節(jié)細胞介導的免疫反應;另外IL-12還可促進T和NK細胞的增殖，提高單核細胞的

6、細胞毒性，通過各種途徑殺傷腫瘤細胞。
　　 近年來，對樹突狀細胞(DC)的深入研究不僅促使了基礎免疫的進展，而且使其在腫瘤免疫治療中的作用越來越受到重視，以DC為基礎的主動免疫療法已成為當今腫瘤生物治療的熱點之一。其原理為應用各種抗原致敏DC使其成為細胞疫苗再回輸體內(nèi)，通過有效激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強烈的抗腫瘤免疫應答而達到治療腫瘤的目的，該療法已成為腫瘤生物治療的又一新興手段。
　　 目前用來“裝載”DC的抗原有死亡的腫

7、瘤細胞、細胞裂解物、凋亡體、純化的蛋白質(zhì)和抗原肽，質(zhì)粒cDNA等。由于膠質(zhì)瘤具異質(zhì)化的特性，即膠質(zhì)瘤中的各種瘤細胞在侵襲能力、生長速度、分化程度、對激素的反應、對抗癌藥物的敏感性等方面均有所不同，使得膠質(zhì)瘤特異性抗原的純化分離相當困難。且最適當?shù)乃拗骺鼓[瘤的T細胞反應需要一系列的抗原決定簇，而不是僅僅局限于某一個抗原決定簇。不斷有研究表明，利用冷凍制備腫瘤抗原，能誘導出腫瘤特異性的或針對多個抗原表位的T細胞反應，在臨床應用中無需鑒定腫瘤

8、抗原表位及患者人類白細胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA);誘導出的針對腫瘤細胞多靶位的多克隆免疫應答，抗原性更強，能夠有效地防止由于抗原變異而引起的免疫逃避。目前，將腫瘤冷凍抗原作為樹突狀細胞致敏物，所制備的樹突狀細胞腫瘤疫苗已成功運用于多種其他腫瘤的實驗研究中。除此之外，我們認為利用氬氦冷凍制備的腫瘤冷凍抗原DC疫苗還有制備簡便、效果顯著、應用安全的優(yōu)勢。
　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)很長時間內(nèi)被認為是免疫豁免

9、區(qū)，這主要和存在血腦屏障(BBB)和缺乏淋巴系統(tǒng)有關(guān)?，F(xiàn)有證據(jù)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫豁免不是絕對的，在一定程度上說，腦組織僅是免疫原性低下的器官，在多種病理情況下，血腦屏障受到破壞而開放，淋巴細胞可以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用。因此，免疫反應可以介入中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的免疫治療奠定了理論基礎。
　　 本研究選用大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞系作為研究對象，首先，氬氦冷凍體外C6膠質(zhì)瘤細胞懸液，制備成腫瘤全細胞冷凍抗原

10、。然后，利用全細胞冷凍抗原，致敏Wistar骨髓源性樹突狀細胞(DC)，形成樹突狀細胞(DC)疫苗;最后，建立C6/Wistar大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型，采用DC疫苗對其進行治療，觀察DC疫苗對荷腦膠質(zhì)瘤大鼠的療效。
　　 第一部分:氬氦冷凍制備大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞凍融抗原
　　 目的:建立大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞系，常規(guī)雙循環(huán)氬氦冷凍法制備全細胞凍融抗原。
　　 方法:選擇大鼠C6膠質(zhì)痛細胞系，應用含血清培養(yǎng)基(DMEM/F

11、12+10％FBS)培養(yǎng)足量膠質(zhì)瘤細胞。收集對數(shù)期生長的細胞制成大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞懸液，無菌狀態(tài)下，常規(guī)雙循環(huán)氬氦冷凍法制備大鼠膠質(zhì)瘤全細胞凍融抗原，并于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br>　　 結(jié)果:大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長，長出突起，呈短梭形、長梭形、星形、長纖維形;這些膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)胰酶消化制備成PBS懸液于離心管內(nèi)，常規(guī)氬氦冷凍法制各大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞時，開啟氬氣能在冷凍探針頂部形成一定范圍的冰球，近似口寬底窄的梭

12、形，開啟氦氣時冰球溶解。循環(huán)冷凍消融時再次形成冰球并溶解。
　　 結(jié)論:采用氬氦冷凍設備體外冷凍C6膠質(zhì)瘤細胞懸液，方法簡單、經(jīng)濟?？赏ㄟ^控制氬氦冷凍設備的參數(shù)，獲取大量理想的全細胞凍融抗原，既能在直觀下觀察冷凍的過程，又為下一步研究DC疫苗準備了足夠的冷凍抗原。
　　 第二部分:膠質(zhì)瘤氬氦凍融產(chǎn)物致敏Wistar大鼠骨髓源性樹突狀細胞治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤大鼠的實驗研究
　　 目的:建立Wistar大鼠骨髓源性樹突狀細

13、胞(DC)的分離和培養(yǎng)方法，觀察經(jīng)氬氦冷凍后C6膠質(zhì)痛細胞凍融產(chǎn)物對wistar大鼠骨髓源性樹突狀細胞(BM-DC)成熟的影響，了解致敏樹突狀細胞(DC)對荷C6腦膠質(zhì)瘤Wistar大鼠的治療作用。
　　 方法:設計雙循環(huán)氬氦冷凍法凍融體外C6膠質(zhì)瘤細胞懸液為實驗組，只插入探針不作冷凍為陰性對照組，雙循環(huán)氬氦冷凍法凍融等量PBS為空白對照組;取wistar大鼠骨髓單核細胞，加入含40ng/mL重組大鼠白細胞介素-4(rmIL-4

14、)、40ng/mL重組大鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用貼壁法純化。培養(yǎng)6天時加入100ngTNF-α，第7天時分別加入各組冷凍產(chǎn)物（按制備凍融抗原前腫瘤細胞數(shù)量與DC數(shù)量3:1的比例），48小時后光鏡下觀察DC細胞形態(tài);收集細胞，流式細胞儀檢測各組DC細胞表面共刺激分子CD80和CD86指數(shù)，ELISA法檢測各組上清液中IL-12含量;立體定向下建立荷腦C6膠質(zhì)瘤Wi

15、star大鼠模型，分別于第3、10天于大鼠皮下注射各組致敏的DC，采用Kaplan-Meier和Log-rank分析比較各組大鼠中位生存期。
　　 結(jié)果:培養(yǎng)第9天的DC（加入凍融產(chǎn)物48小時），實驗組具有成熟DC形態(tài)學特征，表面分子CD80、CD86陽性表達率、培養(yǎng)細胞上清中IL-12的分泌量高于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);實驗組DC疫苗治療的荷腦膠質(zhì)瘤大鼠中位生存期高于陰性對照組和空白對照組，差