TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤中的表達及對膠質(zhì)瘤細胞增殖及凋亡的作用研究.pdf

1、目的:
　　本文通過研究膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細胞系中TNFRSF6B蛋白的表達情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，闡明TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義;同時探討TNFRSF6B對膠質(zhì)瘤細胞生長及凋亡的作用及潛在分子機制，為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷提供生物標記物及為分子靶向治療篩選有益的靶點。
　　材料與方法:
　　1.構(gòu)建膠質(zhì)瘤組織微陣列，應(yīng)用免疫組織化學的方法(EnVision法)，檢測TNFRSF6B蛋白在125例

2、膠質(zhì)瘤組織和18例正常腦組織中的表達和相對含量，并分析TNFRSF6B蛋白的表達水平與膠質(zhì)瘤臨床病理特征、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達、Ki-67表達、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達及病人生存的關(guān)系。
　　2.篩選高表達TNFRSF6B的膠質(zhì)瘤細胞系;將TNFRSF6B中和性抗體加入膠質(zhì)瘤細胞系

3、(U251MG，LN-308，U87MG)中，通過MTS、CellTiter-Blue CellViability Assay、軟瓊脂集落形成及Hoechst33342/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)熒光雙染實驗檢測不同濃度TNFRSF6B中和性抗體作用于不同膠質(zhì)瘤細胞后的細胞存活率;流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測TNFRSF6B中和性抗體加入后膠質(zhì)瘤細胞細胞周期的差異;通過FCM、Caspa

4、se-3/7活性檢測、Hoechst33342/PI熒光雙染等實驗分析TNFRSF6B中和性抗體對凋亡的影響;并使用western blot對TNFRSF6B中和性抗體作用后的膠質(zhì)瘤細胞進行細胞存活，凋亡及侵襲相關(guān)的信號通路蛋白檢測，包括MMP-2，ERK1/2，AKT等。對TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程的作用以及對膠質(zhì)瘤細胞各種生物學功能的影響進行探討，為TNFRSF6B日后的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　3.統(tǒng)計學分析應(yīng)用

5、SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示。腫瘤組織及正常腦組織中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達強度差異使用Mann-Whitney U檢驗，陽性率差異使用卡方檢驗;膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達強度及表達率在不同病理分級中的差異使用Kruskal-Wallis檢驗;膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達強度在不同年齡、性別組的差異使用Mann-Whitney U檢驗，陽性

6、率差異使用卡方檢驗;膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達與病理分級的關(guān)系使用Spearman秩相關(guān)檢驗。Ki-67、PCNA LI等計量資料的相關(guān)統(tǒng)計如滿足正態(tài)分布及方差齊性的要求，兩組比較用成組t檢驗，包括膠質(zhì)瘤vs正常腦組織;病理分級Ⅰ-Ⅱ組vsⅢ-Ⅳ組;TNFRSF6B陽性組vs陰性組等。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊時采用SNK-q檢驗(Student-Newman-Keuls)進行

7、兩兩間顯著性檢驗，方差不齊時先變量轉(zhuǎn)換，如仍不齊則用秩和檢驗中的H檢驗法(Kruskal-Wallis)多組比較用方差分析，如Ki-67、PCNA LI在TNFRSF6B不同表達組的差異。生存資料用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗進行分析，進行分組因素水平間的線性趨勢檢驗。體外實驗中，細胞生長抑制率，細胞克隆數(shù)，細胞周期比例和細胞凋亡數(shù)量，使用均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示。對組間的差異進行檢測，使用方差分析(AN

8、OVA)和student t檢驗分析有無統(tǒng)計學意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.TNFRSF6B陽性信號定位于細胞質(zhì)及細胞膜。125例膠質(zhì)瘤組織中，99例標本可見不同程度陽性表達，TNFRSF6B的陽性表達率為79.2％;18例正常腦組織中，2例標本可見陽性表達，TNFRSF6B的陽性表達率為11.1％。膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B的陽性表達強度率明顯高于正常組織（Z=-4.661，P＜0.001，M

9、ann-Whitney U檢驗），表達率明顯也明顯高于正常組織(x2=24.343，P＜0.001，卡方檢驗)。TNFRSF6B表達隨著膠質(zhì)瘤病理分級的升高而增高，其中強陽性(+++)僅見于Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤病例，Ⅰ～Ⅱ級與Ⅲ～Ⅳ級間TNFRSF6B差異有統(tǒng)計學意義(x2=36.082，P＜0.001)。其中低分級組（Ⅰ-Ⅱ級）陽性率為55.1％（27/49），高分級組（Ⅲ-Ⅳ級）陽性率為94.7％(72/76)。采用Spearman等級相

10、關(guān)法分析顯示，TNFRSF6B蛋白表達水平與病理分級呈正相關(guān)(rs=0.614，P＜0.01)。但TNFRSF6B表達與性別及年齡無明顯相關(guān)，P＞0.05。
　　2.正常腦組織中Ki-67標記指數(shù)(labeling index，LI)為0.08±0.04，明顯低于膠質(zhì)瘤組織的12.47±1.16（t=10.71，P＜0.001）;正常腦組織中PCNA LI為0.03±0.02，明顯低于膠質(zhì)瘤組織的10.86±1.01(t=10.6

11、9，P＜0.001)。膠質(zhì)瘤組織中Ki-67 LI為12.47±1.16，明顯高于PCNA LI的10.86±1.01（t=5.985，P＜0.01）。 Ki-67與PCNA LI呈正相關(guān)(rs=0.978，P＜0.01)。Ki-67及PCNA LI隨膠質(zhì)瘤病理分級的增高而增高。 Ki-67 LI與病理分級呈正相關(guān)（rs=0.851，P＜0.01）;同樣，PCNA LI與病理分級也呈正相關(guān)(rs=0.851，P＜0.01)。Ki-67和

12、PCNA LI與性別、年齡均無關(guān)。TNFRSF6B陰性組Ki-67 LI表達量為3.29±1.04，明顯低于TNFRSF6B陽性組的15.09±1.34（t=6.96，P＜0.001）;TNFRSF6B陰性組PCNA LI表達量為2.78±0.89，也明顯低于TNFRSF6B陽性組的13.17±1.17（t=7.06，P＜0.001）。Ki-67 L1與TNFRSF6B表達呈正相關(guān)（rs=0.459，P＜0.01）;PCNA L1與TN

13、FRSF6B表達亦呈正相關(guān)(rs=0.477，P＜0.01)。
　　3.GFAP蛋白表達與膠質(zhì)瘤病理分級呈負相關(guān)(rs=0.632，P＜0.01)。正常腦GFAP蛋白表達率為100.0％，與Ⅰ-Ⅱ級(81.6％)和Ⅲ-Ⅳ級(39.7％)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Ⅰ-Ⅱ級與Ⅲ-Ⅳ級之間GFAP蛋白表達率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中Ⅳ級的表達率最低，為25.0％。TNFRSF6B與GFAP蛋白表達呈負相關(guān)(

14、rs=-0.397，P＜0.01)。GFAP的蛋白表達與Ki-67(rs=-0.465，P＜0.01)及PCNA LI（rs=-0.483，P＜0.01）均呈負相關(guān)。
　　4.本研究中76例患者具有完整生存期資料。Ki-67與PCNA的表達與生存期密切相關(guān)，證明該生存期資料的可靠性。檢測76例TNFRSF6B表達與患者生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)TNFRSF6B陰性組生存期為50±1.79個月，略高于TNFRSF6B陽性組的47.45±3.1

15、1個月，但其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　5.使用MTS法測定抗TNFRSF6B中和性抗體的細胞增殖抑制效果結(jié)果顯示，在加入無關(guān)抗體hIgG1處理的所有3種膠質(zhì)瘤細胞系中細胞增殖沒有受到任何影響。另外兩種細胞系的LN-308和U87MG中，TNFRSF6B中和性抗體對細胞周期也有類似影響，但影響稍弱。
　　6.使用TNFRSF6B中和性抗體處理后，caspase-3/7的活性在測試的所有3種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系凋亡都明

16、顯增強，并表現(xiàn)出時間和劑量依賴性。該結(jié)果與細胞生長試驗結(jié)果相吻合，TNFRSF6B中和性抗體對caspase-3/7活性的影響最顯著的是U251MG細胞，最適濃度為0.8mg/L，活性最高時間點是TNFRSF6B中和性抗體處理后96小時。同時使用Hoechst33342/PI雙熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)，TNFRSF6B中和性抗體處理組的凋亡明顯增加，結(jié)果與caspase-3/7活性檢測相符。
　　7.最后，我們通過使用免疫印跡檢查了與細胞

17、存活增殖，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2，ERK1/2和AKT的表達量。無關(guān)抗體hIgG1對這些通路的影響不大。但MMP-2，磷酸化ERK1/2和磷酸化-AKT的表達量在經(jīng)過TNFRSF6B中和性抗體處理96小時后下降明顯。
　　結(jié)論:
　　1.TNFRSF6B與膠質(zhì)瘤的病理分級及GFAP表達、細胞增殖狀態(tài)有關(guān)，提示在膠質(zhì)瘤的發(fā)生，發(fā)展過程中，TNFRSF6B的異常表達發(fā)揮重要的作用。
　　2.TNFRSF6B的高表