膠質(zhì)瘤中皮層肌動蛋白表達和其在膠質(zhì)瘤細胞運動中的作用的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤作為最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，約占成人全身腫瘤的2％。統(tǒng)計表明其中的一半以上是最高度惡性膠質(zhì)瘤-膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)，其以侵襲性生長，微衛(wèi)星灶，或散在腫瘤細胞的形式浸潤于周圍正常腦實質(zhì)著稱，是人類難治性腫瘤之一[1-5]。盡管手術(shù)切除及術(shù)后輔助同步放化療方案應用于膠質(zhì)母細胞瘤患者取得了一定效果，但多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的五年生存率仍然不到10％，對于老年的患者來說生存率更低[

2、6-10]。
　　肌動蛋白成核促進因子之一的皮層肌動蛋白被證明不僅僅是肌動蛋白骨架動力學的調(diào)節(jié)因子，也是癌癥侵襲過程中的重要一員。皮層肌動蛋白作為一多結(jié)構(gòu)域蛋白，其氨基末端為酸性結(jié)構(gòu)域、接著是六個半的重復序列、α螺旋、富含脯氨酸的片段、最后是羧基端的SH3區(qū)域。皮層肌動蛋白最開始被認為是非受體酪氨酸激酶重要的作用底物。從那時起，越來越多的研究表明，皮層肌動蛋白在腫瘤的浸潤和發(fā)展中起到了重要作用。過去十年中，眾多關(guān)于皮層肌動蛋白的研

3、究著重于其在腫瘤細胞運動中所起的作用。皮層肌動蛋白作為一多結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)蛋白，其可以通過多種方式調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合、解聚并可以進一步影響細胞的“運動器官”-片狀偽足的形成、維持[11]。皮層肌動蛋白N末端序列可以直接與Arp2/3復合體(Arp2/3 complex)結(jié)合而調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的聚合、解聚，其還可以通過其結(jié)構(gòu)域:Src同源結(jié)構(gòu)域3(SH3)與神經(jīng)奧爾德里奇綜合征復合體(N-WASP)等的結(jié)合而調(diào)節(jié)上述過程[12]。以往的研究表明

4、，該蛋白在乳腺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等腫瘤中過表達并與預后不良密切相關(guān)[13-15]，而其在膠質(zhì)瘤中的表達及其與膠質(zhì)瘤細胞運動的關(guān)系仍未被證實。
　　本課題主要研究皮層肌動蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達和其調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲及其可能機制的研究，分為以下三個部分:
　　1.皮層肌動蛋白在人膠質(zhì)瘤中的表達情況。為探討皮層肌動蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達情況，我們收集了40例不同病理級別的膠質(zhì)瘤標本以及8例顳葉癲癇手術(shù)中獲得的非腫瘤腦組織。

5、本課題在實驗過程中，首先采用免疫組化檢測不同標本中皮層肌動蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，皮層肌動蛋白在非腫瘤腦組織中表達呈弱陽性，而在膠質(zhì)瘤組織標本中表達強度明顯增強并且其染色強度隨著腫瘤級別的增高而增強(F=41.160，P=0.000)。
　　Western blotting結(jié)果顯示對照腦組織當中皮層肌動蛋白表達量為18.20±2.52％(n=8)，WHOⅡ級膠質(zhì)瘤標本中表達量為36.20±3.34％(n=15)，WHOⅢ級膠質(zhì)瘤

6、標本中表達量為51.40±4.30％(n=9)，WHOⅣ級膠質(zhì)瘤標本中表達量為59.60±4.31％(n=16)。數(shù)據(jù)分析顯示，膠質(zhì)瘤中皮層肌動蛋白表達量高于對照腦組織(P＜0.01)，并且皮層肌動蛋白表達量與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)(r=0.912, P=0.00)。
　　2.皮層肌動蛋白在膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲中的作用。我們選擇人膠質(zhì)瘤細胞系U251、SNB19和LN229進行體外研究，分為三組，siRNA-cortactin組

7、（轉(zhuǎn)入特異性干擾RNA）、siRNA-NC組（轉(zhuǎn)入陰性對照RNA序列）及siRNA-N組（轉(zhuǎn)入空載體）。QRT-PCR及Western blotting檢測皮層肌動蛋白表達的下調(diào)，體外劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果:皮層肌動蛋白表達被明顯抑制，抑制后膠質(zhì)瘤細胞的遷移侵襲能力明顯下降(P＜0.05)。
　　3.皮層肌動蛋白促進膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的可能機制。免疫熒光觀察皮層肌動蛋白表達抑制后膠質(zhì)瘤

8、細胞片狀偽足的變化。免疫熒光法驗證皮層肌動蛋白與Arp2/3復合體在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的定位。免疫共沉淀(Co-IP)實驗驗證兩者在細胞內(nèi)的結(jié)合。結(jié)果:抑制皮層肌動蛋白表達后，膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足減小且持續(xù)時間縮短。免疫熒光顯示皮層肌動蛋白與Arp2/3復合體共定位于膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)片狀偽足形成的富含肌動蛋白的區(qū)域。免疫共沉淀結(jié)果顯示二者在細胞內(nèi)存在結(jié)合狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　1.皮層肌動蛋白在膠質(zhì)瘤組織中表達較對照腦組織明顯升高，并且