人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞功能性甲?；氖荏w（FPR）促血管生成作用.pdf

1、惡性實(shí)體瘤(malignant solid tumors)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤內(nèi)血管生成(angiogenesis)。因此，血管生成機(jī)制和抗血管生成一直是近些年腫瘤研究領(lǐng)域和前沿之一。人腦惡性膠質(zhì)瘤血管生成十分活躍，且微血管密度越高，患者預(yù)后越差。所以，以膠質(zhì)瘤為模型研究腫瘤血管生成機(jī)制和抗血管生成治療方法。 人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，瘤細(xì)胞通過分泌大量血管生成因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管型形成而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。在這一過程中血管內(nèi)皮

2、生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)是重要的促血管生成因子。越來越多的證據(jù)表明，G-蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體在腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，G-蛋白偶聯(lián)的甲?；氖荏w(formylpeptide receptor，F(xiàn)PR)與膠質(zhì)瘤級(jí)別和微血管密度密切相關(guān)，即它可能具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的功能。但其促血

3、管生成作用機(jī)制和治療學(xué)意義尚需探討。 近年發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在少量具有自我更新、多潛能和啟動(dòng)與重建腫瘤組織表型能力的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)。這些干細(xì)胞是否參與血管生成缺乏研究。直到最近有報(bào)道，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在缺氧條件下可生成VEGF，提示其參與血管生成，但詳細(xì)機(jī)制不清。由于近年來有報(bào)道某些正常干細(xì)胞表達(dá)FPR，我們推測(cè)，腫瘤干細(xì)胞可能也表達(dá)FPR并介導(dǎo)血管生成。 為了進(jìn)一步了解FPR在

4、膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成中的作用及其機(jī)制，我們分別對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及其中的CD133<'+>膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)的FPR在血管生成中的作用進(jìn)行了研究，并對(duì)FPR是否可能成為膠質(zhì)瘤抗血管生成治療的新靶點(diǎn)進(jìn)行探索。首先，我們檢測(cè)了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中FPR的表達(dá)及其活化后促細(xì)胞增殖和血管生成因子產(chǎn)生的作用，觀測(cè)我室自行合成的抗癌化合物諾帝(Nordy)對(duì)FPR所介導(dǎo)的上述效應(yīng)的抑制作用；然后，我們對(duì)U87細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的細(xì)

5、胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定；最后，我們研究了從U87細(xì)胞內(nèi)分離得到的具有干細(xì)胞特性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及其表達(dá)的功能性FPR在血管生成中的作用。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1．人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87表達(dá)功能性FPR，活化后介導(dǎo)細(xì)胞增殖及VEGF和IL-8產(chǎn)生。采用免疫熒光染色法檢測(cè)U87、FPR-siRNA-U87(FPR基因的siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)87細(xì)胞內(nèi)以干擾FPR在U87細(xì)胞的表達(dá))和FPR-mock-U87細(xì)胞(將空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染

6、入U(xiǎn)87細(xì)胞)FPR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，U87和FPR-mock-U87細(xì)胞均表達(dá)FPR，而絕大多數(shù)FPR-siRNA-U87細(xì)胞不表達(dá)FPR，僅處于分裂期的細(xì)胞表達(dá)FPR。來用MTT、ELISA和RT-PCR法檢測(cè)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的FPR活化后的效應(yīng)，結(jié)果顯示：①U87和FPR-mock-U87細(xì)胞的fMLF刺激組OD值均較對(duì)照組顯著升高，P<0.05；而FPR-siRNA-U87細(xì)胞的fMLF刺激組OD值在各時(shí)相點(diǎn)與對(duì)照組

7、相比無明顯差異(P>0.05)；②U87和FPR-mock-U87細(xì)胞fMLF刺激組VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基上清中蛋白分泌量均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；FPR-siRNA-U87細(xì)胞fMLF刺激組VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基中蛋白分泌量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87表達(dá)功能性FPR，其活化后促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成因子VEGF和IL-8的產(chǎn)生和分泌。

8、 2．自行合成的抗癌化合物諾帝對(duì)U87細(xì)胞FPR表達(dá)和活化后效應(yīng)具有抑制作用。①100μmol/L諾帝處理12h和24h后，U87細(xì)胞FPR平均吸光度值(AOD)分別為(582.4±173.46)和(478.852±107.43)，與對(duì)照組U87細(xì)胞(1332.1±275.26)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，②以100μmol/L諾帝和100nmol/L fMLF處理24h后，與對(duì)照組相比，U87細(xì)胞透亮度和折光性降低，細(xì)胞活

9、力下降。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，諾帝對(duì)fMLF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用；③ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，諾帝處理組U87細(xì)胞的VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基上清中蛋白分泌量均較對(duì)照組顯著降低。上述結(jié)果表明，諾帝對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的FPR表達(dá)和該受體活化后的促瘤細(xì)胞增殖及血管生成因子VEGF和IL-8的分泌具有抑制作用。 3．人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中存在具有增殖、自我更新和高成瘤能力的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。①免疫熒光染色

10、和流式檢測(cè)結(jié)果顯示，人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中包含有CD133<'+>細(xì)胞，其比例為0.5％。②磁珠分選獲得的CD133<'+>細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中可形成克隆性細(xì)胞球，CD133<'+>細(xì)胞形成的細(xì)胞球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物nestin和CD133，不表達(dá)分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，而且CD133<'+>細(xì)胞球在含血清的常規(guī)培養(yǎng)中可分化為貼壁細(xì)胞，形態(tài)與親本U87細(xì)胞相似。③CD133<'+>細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力明顯強(qiáng)于CD13

11、3<'->細(xì)胞；且其增殖指數(shù)(PI％)顯著高于CD133-細(xì)胞移植瘤(P<0.05)；從形成的移植瘤組織中分離獲得的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)，CD133<'+>細(xì)胞占5％，CD133<'+>細(xì)胞移植瘤組織高表達(dá)nestin和vimentin，低表達(dá)GFAP，而CD133<'->細(xì)胞移植瘤組織低表達(dá)nestin和vimentin，高表達(dá)GFAP。④采用體內(nèi)連續(xù)傳代法檢測(cè)顯示，CD133<'+>細(xì)胞移植瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞形成的克隆性細(xì)胞球接種于裸鼠體

12、內(nèi)，可再次形成組織特征與CD133<'+>細(xì)胞移植瘤相似的腫瘤。上述結(jié)果表明，人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中包含有具有體內(nèi)成瘤、無限增殖和自我更新能力的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。 4．膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)FPR，活化后具有促血管生成作用。①免疫熒光染色顯示，CD133和G蛋白偶聯(lián)受體FPR共表達(dá)于CD133<'+>細(xì)胞形成的細(xì)胞球表面。②鈣流檢測(cè)結(jié)果顯示，在細(xì)胞外無鈣離子存在的條件下，10<'-4>～10<'-7>mmol/L fMLF與CD

13、133<'+>細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體FPR結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>升高。fMLF誘導(dǎo)的CD133<'+>細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)效應(yīng)呈劑量依賴性，胞內(nèi)[Ca<'2+>]i流動(dòng)包括一個(gè)上升過程、一個(gè)持續(xù)平臺(tái)期及一個(gè)緩慢下降期。③ELISA檢測(cè)顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(CD133<'+>細(xì)胞)自身能夠分泌較多的VEGF。④將膜熒光染料CFSE標(biāo)記的CD133<'+>細(xì)胞移植入裸鼠體內(nèi)后的結(jié)果顯示，裸鼠皮下移植瘤新生血管(CD105標(biāo)記)多位于CFSE

14、標(biāo)記的CD133<'+>膠質(zhì)瘤干細(xì)胞周圍；免疫組化染色顯示，移植瘤組織表達(dá)的VEGF及微血管密度(MVD)顯著高于CD133<'->細(xì)胞移植瘤。⑤ELIsA檢測(cè)顯示，10<'-4>～mmol/L fMLF可增加CD133<'+>細(xì)胞VEGF蛋白分泌，與對(duì)照組相比(無fMLF刺激)，具有顯著性統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05)。上述結(jié)果表明，U87細(xì)胞中存在的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)功能性。FPR，其活化后可促進(jìn)VEGF的分泌，VEGF在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞介導(dǎo)的

15、血管生成中具有重要作用。 綜上所述，(1)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87表達(dá)的FPR被激活后，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖以及血管生成因子產(chǎn)生和分泌的功能，諾帝對(duì)U87細(xì)胞FPR表達(dá)和該受體活化后的促瘤細(xì)胞增殖及血管生成因子的產(chǎn)生和分泌具有抑制作用；(2)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞群體中存在少量具有增殖、自我更新和高成瘤能力的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并首次發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)功能性FPR，活化后具有促血管生成作用。上述研究結(jié)果為惡性膠質(zhì)瘤抗血管生成治療提