魚(yú)類IL-1Ra-like基因的分子克隆和原核表達(dá).pdf

1、Interleukin-1(IL-1)家族是一類多功能的細(xì)胞因子，目前在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了11個(gè)成員(IL-1F1～I(xiàn)L-1F11)，通過(guò)IL-1受體(IL-1 Receptor)家族發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，參與啟動(dòng)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)，是脊椎動(dòng)物中才出現(xiàn)的一類重要的免疫細(xì)胞因子。因此，在低等脊椎動(dòng)物中對(duì)IL-1的研究對(duì)該家族的起源和進(jìn)化有著非常重要的意義。IL-I家族中的IL-1F5，IL-1F10和IL-1 receptor anta

2、gonist(IL-1Ra)在進(jìn)化樹(shù)上有著非常接近的關(guān)系，三者很可能起源于同一個(gè)IL-1Ra樣的祖先分子。而目前的研究發(fā)現(xiàn)IL-1F5與IL-1R家族的成員single immunoglobulinIL-1R related molecule(SIGIRR)有著密切的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-1F5可能通過(guò)SIGIRR發(fā)揮免疫調(diào)控的作用。在魚(yú)類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了存在SIGIRR的同系物doubleimmunoglobulin IL-IR relat

3、ed molecule(DIGIRR)，但是至今在魚(yú)類或其他低等脊椎動(dòng)物中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)除了1L-1β和IL-18之外的IL-1家族成員。
　　 本文運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，成功地發(fā)現(xiàn)和克隆了魚(yú)類IL-1家族中的一個(gè)重要成員IL-1Ra-like(TnIL-1Ra-like)，進(jìn)行了IL-1Ra-like的基因結(jié)構(gòu)分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析、原核表達(dá)和蛋白純化研究。同時(shí)我們還預(yù)測(cè)了多種魚(yú)類中IL-IRa-like可能的受體分子DIGIRR基因，

4、構(gòu)建了DIGIRR綠色熒光真核表達(dá)載體，并在HepG2細(xì)胞完成了DIGIRR-EGFP融合蛋白的表達(dá)。
　　 TnIL-1Ra-like cDNA ORF序列長(zhǎng)591bp，TnIL-1Ra基因編碼由196個(gè)氨基酸組成、分子量為22.4kDa、pI為6.45的多肽?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示TnIL-1Ra與哺乳動(dòng)物中的IL-1Ra，IL-1F5及IL-1F10結(jié)構(gòu)相似，都含有四個(gè)編碼外顯子，除第一個(gè)外顯子大小有所差異，其余三個(gè)外顯子都較一

5、致，提示三者較相近的進(jìn)化關(guān)系。序列比對(duì)顯示TnlL-1 Ra-like與其它物種IL-1Ra，IL-1F5及IL-1F10之間的氨基酸有一定的相似度，但是物種間的差異較大，說(shuō)明IL-IRa在進(jìn)化中的保守程度不高。將TnlL-1 Ra-like的ORF亞克隆到原核表達(dá)載體pET28a上，得到重組載體TnlL-1Ra-like-pET28a，經(jīng)測(cè)序表明，目的基因序列及讀碼框均正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功。用IPTG誘導(dǎo)使表達(dá)菌株大量表達(dá)目的蛋白，