AtUGAE4反義基因轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥及對(duì)細(xì)胞粘連性的影響.pdf

1、植物單細(xì)胞懸浮系可以提供大量的遺傳背景和生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞，因而在進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究、突變細(xì)胞株篩選、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、基岡功能分析和遺傳工程等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。但是，由于植物細(xì)胞間的相且粘連作用難以消除，至今尚未能獲得植物單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系。在生長(zhǎng)的植物細(xì)胞中，細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠以及少量的結(jié)構(gòu)蛋白組成：其中，果膠對(duì)植物細(xì)胞粘連起重要作用。果膠是由UDP-半乳糖醛酸(UDP-α-D-galacturonic acid，

2、即UDP-GalA)構(gòu)成的同質(zhì)高分子或與其他單糖構(gòu)成的雜合高分子。在植物中，UDP-半乳糖醛酸由UDP-葡糖醛酸差向異構(gòu)酶(UDP-GlcA 4-epimerase，即UGAE)催化UDP-葡萄糖醛酸(UDP-α-D-glucuronic acid，即UDP-GlcA)而合成。因此，若能夠抑制UDP-葡糖醛酸差向異構(gòu)酶基岡在植物中的表達(dá)，則可能抑制果膠的生物合成，減少細(xì)胞間的粘連性，為獲得植物單細(xì)胞系創(chuàng)造有利條件。 本論文自擬南

3、芥中克隆了AtUGAE4基因的家族保守序列，構(gòu)建成反義基因表達(dá)載體。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，分別對(duì)煙草和擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，獲得了4株煙草再生植株和大量擬南芥的愈傷組織，以期構(gòu)建的AtUGAE4反義基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)，產(chǎn)生與該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義mRNA片段，從而抑制該基因及其整個(gè)家族基岡的表達(dá)，達(dá)到抑制果膠生物合成，降低細(xì)胞間粘連性的目的。主要研究結(jié)果包括以下兒個(gè)方面： 1.AtUGAE4基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Xba

4、Ⅰ/SacⅠ酶切克隆載體pMD-UGAE4和表達(dá)載體pV-HSP70bGIJS，分別回收AtUGAE4基因片段和pV-HSP70bGUS質(zhì)粒大片段，并連接，得到含有HSP70b-reAtUGAE-Tnos反義基因表達(dá)盒的表達(dá)載體pV-70bbrUGAE4。該反義基因表達(dá)載體經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定正確無(wú)誤后導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，用于遺傳轉(zhuǎn)化。 2.AtUGAE4反義基因轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將AtUGA

5、E4反義基閃分別轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥。獲得4株具有卡那霉素抗性的煙草植株和人量具有卡那霉素抗性的擬南芥愈傷組織。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，均能檢測(cè)到AtUGAE4基岡的目標(biāo)條帶，而非轉(zhuǎn)化植株呈陰性，初步證明外源基因已整合到煙草和擬南芥的基因組中。具有卡那霉素抗性的煙草植株的根組織和擬南芥愈傷組織在395nm的光激發(fā)下，能在熒光顯微鏡下檢測(cè)到綠色熒光，證實(shí)GFP基因及與之連鎖的HSP70b-reAtUGE4反義基因已分別整合進(jìn)了煙草和擬南芥核基因組

6、。 3.AtUGAE4反義基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析 煙草轉(zhuǎn)化后，再生難，為數(shù)不多的分化芽大都發(fā)育為畸形苗，僅獲得四株轉(zhuǎn)基因煙草植株，37℃下熱激36小時(shí)無(wú)形態(tài)異常，推測(cè)AtUGAE4反義基因抑制了煙草的果膠合成，引起細(xì)胞壁合成障礙并使轉(zhuǎn)基岡煙草在發(fā)育過(guò)程中致死或畸形，而形成完整再生植株的可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)入了多拷貝基因，產(chǎn)生了共抑制效應(yīng)，大人減弱了反義RNA的干擾作用。 4.AtUGAE4反義基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥愈傷