單鏈TRAIL重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，是腫瘤壞死因子超家族成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白。人TRAIL由281aa組成，其編碼序列有843bp。C端41～281aa為胞外區(qū)，可經(jīng)半胱氨酸蛋白酶水解為只含有C端114～281aa的可溶性TRAIL114～281[2]；但在體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)該可溶性分子被酶從膜上切下[3]。TRAIL通過特異性的死亡受體(TRAIL—R1/DR4、TRAIL—R2/DR5)來誘導(dǎo)凋亡[3][4]

2、。膜結(jié)合型TRAIL和TRAIL114—281在體外均能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。TRAIL通過一個(gè)Zn2+與3個(gè)配體亞單位中第230位的半胱氨酸螯合，形成頭尾相接的鐘形三聚體，而這種同源三聚體的形式則是TRAIL和受體相結(jié)合時(shí)，發(fā)揮活性的功能模式[5]。
　　 由于TRIL114～281擁有較廣的抗瘤譜，且對(duì)正常組織細(xì)胞幾乎無毒性，近年來作為新型抗腫瘤藥物走入臨床應(yīng)用，并已顯示出良好的腫瘤殺傷效果。但是，由于體現(xiàn)抗腫瘤活性的TR

3、AIL三聚體是由三段單體僅僅通過Zn2+絡(luò)合而成，因此結(jié)構(gòu)較為松散，不是很穩(wěn)定，在使用時(shí)易降解而降低抗腫瘤的效果。
　　 Anja Krippner—Heidenreich等成功地將三聚體TNF的三個(gè)單體以柔性肽鏈(GGGS)3或(GGGS)4連接成單鏈化的TNF(scTNF)。單鏈化后的scTNF仍然保持原先的三聚體結(jié)構(gòu)，且穩(wěn)定性增強(qiáng)，毒性減小，抗腫瘤活性略有增強(qiáng)[6]。
　　 本研究中，我們嘗試將人TRAIL114～

4、281三聚體的三個(gè)單體的氨基酸片段以兩段柔性氨基酸短臂(GGGS)3，頭尾相連，使之融合成為一條多肽鏈scTRAIL，即：TRAIL114～281—(GGGS)3—TRAIL114～281—(GGGS)3—TRAIL114～281，以增強(qiáng)抗腫瘤的效果。通過PCR和限制性內(nèi)切酶酶切、連接技術(shù)，獲得編碼單鏈化蛋白scTRAIL的基因序列，構(gòu)建了含編碼人scTRAIL，基因的重組質(zhì)粒，在宿主菌E．coli BL21中得到了較高水平的表達(dá)，并用

5、麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了初步純化，獲得了融合了麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的可溶性重組蛋白MBP—scTRAIL。最后，對(duì)MBP—scTRAIL的生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。
　　 第一部分scTRIL編碼序列的構(gòu)建和重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化
　　 以pBV220—TRAIL114～281為模板，設(shè)計(jì)三對(duì)引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增三段修飾后的TRAIL114～281單體編碼序列T1、T2和T3，使得每段單體上附帶一小段柔性

6、氨基酸鏈接臂的編碼序列；再利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得T23；以pMAL—C2x為載體，利用酶切連接技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL—T1和pMAL—T23；最后，以pMAL—T23為載體質(zhì)，粒，T1為目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL—T123。至此，獲得重組蛋白scTRAIL的基因編碼序列。
　　 以E．coil BL21為表達(dá)宿主菌，用測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMAL—T123進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆菌落用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋

7、白MBP—scTRAIL，并用MBP親和層析柱純化。經(jīng)SDS—PAGE和免疫印跡驗(yàn)證，在預(yù)期分子量(約110KD)的位置可見明顯蛋白條帶。
　　 第二部分scTRAIL生物學(xué)活性研究
　　 用體外藥物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組蛋白的誘導(dǎo)凋亡活性。體外培養(yǎng)正常細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC)和兩種不同來源的腫瘤細(xì)胞(大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI—H460和人胰腺膽管上皮細(xì)胞SW1990)，分不給藥的空白對(duì)照組、加MBP—scTRAIL組、MB

8、P—TRAIL114—281組和MBP組，加蛋白藥物組對(duì)比對(duì)照組，計(jì)算抑制率，評(píng)價(jià)重組蛋白的生物學(xué)活性。
　　 通過急毒試驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白的急性毒性。用ICR小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射MBP—scTRAIL溶液，連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計(jì)小鼠的死亡率，觀察存活小鼠的形態(tài)、行為變化，評(píng)價(jià)該重組蛋白作為體內(nèi)用藥的急毒安全性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 編碼scTRAIL的基因序列得以成功地構(gòu)建并克隆，重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中較