20337.重組人單鏈il23的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)活性的鑒定

1、學(xué)位論文重組人單鏈重組人單鏈ILIL2323的構(gòu)建、表達(dá)及生物的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)活性的鑒定學(xué)活性的鑒定ConstructionexpressionofrecombinanthumansinglechainIL23identificationofitsbiologicactivity論文類別：論文類別：學(xué)術(shù)研究型學(xué)術(shù)研究型作者姓名指導(dǎo)教師姓名指導(dǎo)教師姓名申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士學(xué)位授予單位學(xué)位授予單位學(xué)科專業(yè)免疫學(xué)免疫學(xué)研究方向抗感

2、染免疫抗感染免疫論文答辯時(shí)間論文答辯時(shí)間2012年5月學(xué)位授予日期學(xué)位授予日期2012年6月答辯委員會(huì)主席：答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：人：2012年4月分類號(hào)密級(jí)學(xué)校代碼UDC編號(hào)學(xué)號(hào)1重組人單鏈IL23的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的鑒定??摘要目的：(1)構(gòu)建重組人單鏈IL23(hscIL23)融合基因及pMD18ThscIL23質(zhì)粒；(2)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a()hscIL23和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1()hscIL23

3、(3)原核表達(dá)hscIL23重組蛋白；(4)真核表達(dá)hscIL23重組蛋白；(5)初步鑒定真核表達(dá)的hscIL23的生物學(xué)活性。方法：(1)設(shè)計(jì)引物應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)通過一柔性接頭（linker）(Gly4Ser)3串聯(lián)擴(kuò)增自本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pMD18Tp40質(zhì)粒和pMD18Tp19質(zhì)粒的IL23p40和p19亞基基因，使p40亞基基因在前，p19亞基基因在后，即p40linkerp19（簡(jiǎn)寫為hscIL23）。將hscIL23融

4、合基因插入至pMD18T載體中，經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證融合基因是否正確。(2)提取pMD18ThscIL23質(zhì)粒DNA，經(jīng)HindⅢ和NheI雙酶切，純化后的酶切產(chǎn)物hscIL23基因通過T4連接酶與經(jīng)和HindⅢNheI雙酶切并純化的pcDNA3.1()真核表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1()hscIL23，采用同樣的方法構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a()hscIL23。(3)將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a()hscIL23轉(zhuǎn)化至大腸

5、埃希菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，采用SDSPAGE電泳和Westernblot分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物。(4)pcDNA3.1()hscIL23質(zhì)粒按不同比例通過陽離子聚合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1()質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染48h后分別收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清。以人IL23ELISA試劑盒鑒定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中hscIL23融合蛋白的含量，通過與標(biāo)準(zhǔn)品