厚樸酚對(duì)戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠行為及海馬BDNF表達(dá)的影響.pdf

1、目的:癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)中一種常見的慢性疾病，影響著約全世界大約有1％-2％人口，具有較高的發(fā)生率和死亡率。其臨床特征為短暫性、發(fā)作性、重復(fù)性、刻板性。電生理特征為腦內(nèi)神經(jīng)元高度同步化異常放電。以神經(jīng)元凋亡，尤其是海馬等邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元凋亡伴膠質(zhì)細(xì)胞增生為主要病理改變。目前，有效藥物治療僅能控制住70％的癲癇發(fā)作，仍有30％癲癇患者發(fā)展成難治性癲癇，約30-40％的患者伴有認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為記憶力減退、語言障礙、執(zhí)行力差、社會(huì)認(rèn)知障礙等方

2、面。因此，癲癇仍然是困擾人類的一大難題，尋求一種既能控制癲癇發(fā)作又能改善認(rèn)知功能的藥物迫在眉睫。
　　本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為戊四氮點(diǎn)燃的慢性癲癇大鼠模型，分別用厚樸酚(magnolol，Mag)高、中、低三個(gè)劑量對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，統(tǒng)計(jì)點(diǎn)燃率來反應(yīng)癲癇發(fā)作情況，通過Morris水迷宮檢測致癇大鼠認(rèn)知功能，應(yīng)用WesternBlot及免疫組化方法檢測BDNF(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)在海

3、馬組織中的表達(dá)情況，以觀察厚樸酚對(duì)戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠的行為、認(rèn)知及海馬BDNF表達(dá)的影響，并初步探討厚樸酚對(duì)戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　方法:選用健康清潔的雄性SD大鼠75只，體重約為250-300g。采用隨機(jī)對(duì)照分組原則，分為正常對(duì)照組(NC組)、戊四氮組（PTZ組）、低劑量厚樸酚組（L組）、中劑量厚樸酚組（M組）、和高劑量厚樸酚組（H組），每組大鼠15只。自實(shí)驗(yàn)第一天起，

4、每天上午10點(diǎn)除NC組外各組大鼠腹腔注射PTZ35mg/kg，NC組大鼠注射相同計(jì)量的生理鹽水，共計(jì)42天。L組、M組和H組于注射PTZ前半小時(shí)分別通過腹腔注射低劑量(2.5mg/kg)厚樸酚、中劑量(5mg/kg)厚樸酚、高劑量(10mg/kg)厚樸酚。打藥后分別觀察大鼠癲癇發(fā)作情況1小時(shí)，依據(jù)Racine分級(jí)來評(píng)價(jià)大鼠癲癇發(fā)作等級(jí)。于藥物注射結(jié)束24小時(shí)后，進(jìn)行Morris水迷宮測試評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力，從而評(píng)估認(rèn)知受損情況。水迷宮實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)束后斷頭取腦分離海馬組織，用Western Blot方法檢測BDNF蛋白表達(dá)水平;對(duì)相關(guān)腦組織固定，用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化或者免疫組織化學(xué)方法觀察BDNF在海馬中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1行為學(xué)觀察 PTZ組大鼠從第4-6天開始反復(fù)出現(xiàn)洗臉、點(diǎn)頭及面部抽搐等表現(xiàn)，第7-15天出現(xiàn)單側(cè)前肢或雙前肢抬起、全身肌陣攣，最終出現(xiàn)全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作，達(dá)到Racine分級(jí)完全點(diǎn)燃的標(biāo)準(zhǔn)。截止到第42天，點(diǎn)燃大鼠毛

6、發(fā)無光澤，精神萎靡，飲食尚可，體重未出現(xiàn)明顯變化。PTZ組大鼠點(diǎn)燃率為93.3％，明顯高于L組、M組、H組和NC組(P＜0.05)。與PTZ組大鼠相比，厚樸酚給藥組大鼠點(diǎn)燃時(shí)間延長，發(fā)作等級(jí)明顯降低，第8-10天大鼠開始出現(xiàn)洗臉、點(diǎn)頭及面部抽搐等表現(xiàn)。截止到第42天，厚樸酚給藥組大鼠中L組、M組、H組大鼠點(diǎn)燃率分別為6.7％、13.3％、33.3％，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2水迷宮測試結(jié)果定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果:①以各組大鼠每日逃避潛伏期均值進(jìn)行比較。(1)實(shí)驗(yàn)第1天，PTZ組大鼠的逃避潛伏期（71.635±6.905）與NC組大鼠（42.206±8.316）相比有所延長，與PTZ組相比，H組（60.158±6.302）、M組（57.426±5.912）和L組（59.346±7.213）的逃避潛伏期均有所縮短，但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)第2天，各組大鼠逃避潛伏期均比第1天明顯縮短(P＜0.05)，PTZ組的逃避潛伏期（

8、28.563±4.372）與NC組（8.452±2.121）相比明顯延長(P＜0.05);與PTZ組相比，H組（21.260±5.165）、M組（17.123±5.272）和L組（20.145±4.265）的逃避潛伏期均有所縮短(P＜0.05)，且與NC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)第3天，各組大鼠逃避潛伏期均較第2天明顯縮短(P＜0.05)，NC組（6.258±2.192）、PTZ組（23.456±4.265）、H組（15

9、.321±4.132）、M組（12.365±3.234）、L組（14.259±3.124）的逃避潛伏期相互比較結(jié)果同第2天。(4)各組大鼠逃避潛伏期均較第3天又明顯縮短(P＜0.05)，NC組（4.625±1.151）、PTZ組（16.235±2.532）、H組（8.632±2.171）、M組（7.235±1.185）、L組（9.125±1.905）的逃避潛伏期相互比較結(jié)果與第3天相同。提示PTZ致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，厚樸酚可以部分

10、改善其學(xué)習(xí)記憶能力。②空間探索試驗(yàn)結(jié)果:PTZ組大鼠（2.78±1.05）與NC組大鼠（19.73±3.21）相比，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05);與PTZ組相比，H組（8.63±2.73）、M組（12.71±2.74）、L組（10.89±3.41）穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P＜0.05)，與NC組相比亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示慢性癲癇大鼠的空間記憶能力下降，而厚樸酚可以改善其空間記憶能力。
　　3透射電鏡觀察海馬CA

11、1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化 NC組電鏡觀察:神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器豐富，可見圓形或橢圓型線粒體，線粒體嵴清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體發(fā)達(dá)，突觸前后膜結(jié)構(gòu)清晰，靠近突觸前膜可見許多突觸囊泡，突觸間隙清晰。PTZ組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，線粒體腫脹，嵴變少，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，突觸數(shù)量減少，突觸前后膜模糊不清，突觸間隙增寬，突觸囊泡數(shù)量減少。L組及M組海馬神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，無固縮現(xiàn)象，細(xì)胞器的形態(tài)基本正常

12、，突觸數(shù)量基本不減少，突觸前后膜較清楚，突觸前膜的囊泡數(shù)量較多。H組海馬神經(jīng)元可見線粒體腫脹，嵴變少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，突觸囊泡數(shù)量較少，間隙增寬。
　　4 BDNF免疫組化結(jié)果 NC組、PTZ組、L組、M組及H組大鼠海馬組織中均可見到彌漫分布的BDNF免疫反應(yīng)產(chǎn)物，陽性細(xì)胞主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，為染色較深的棕褐色顆粒。NC組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)分別為（85.672±6.566，87.369±6.354）;PTZ組海

13、馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)分別為（37.743±7.393，35.521±5.231）;H組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)分別為(34.245±5.051，34.965±5.967);M組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)分別為（69.662±6.093，68.348±6.147）;L組海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)分別為（55.863±8.125，57.625±7.159）。與L、

14、M組及N組相比，PTZ組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）;與H組相比，PTZ組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)升高，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與N組相比，L組、M組、H組海馬CA1及CA3區(qū)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降(P＜0.05)，N組與L組、M組、H組之間兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5 BDNF Western blot結(jié)果與L組（1.148±0.112

15、）、M組（1.972±0.158）及N組（2.317±0.163）相比，PTZ組海馬BDNF蛋白表達(dá)水平（1.215±0.167）明顯降低(P＜0.05);與H組（1.148±0.112）相比，PTZ組海馬BDNF蛋白表達(dá)水平升高，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與N組相比，L組、M組、H組海馬BDNF蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），N組與L組、M組、H組之間比較海馬BDNF蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　

16、結(jié)論:
　　1本實(shí)驗(yàn)采用戊四氮化學(xué)點(diǎn)燃方法成功建立了伴有認(rèn)知功能損害的慢性癲癇大鼠模型。
　　2癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致透射電鏡下大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　3癲癇發(fā)作可導(dǎo)致大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)下降。
　　4厚樸酚能夠降低大鼠癲癇發(fā)作率并且改善致癇大鼠認(rèn)知功能。進(jìn)而推測其可能機(jī)制為通過上調(diào)大鼠海馬組織中BDNF水平從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。
　　5本實(shí)驗(yàn)中，5mg/kg厚樸酚劑量可能為改善認(rèn)知功能且降低