戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬凋亡誘導(dǎo)因子的表達(dá)變化.pdf

1、目的：癲癇是以腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致反復(fù)、發(fā)作性和短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，其發(fā)病機(jī)制不清。
　　 癲癇可致腦損傷，細(xì)胞凋亡或稱程序化細(xì)胞死亡啟動(dòng)一系列復(fù)雜的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是癲癇致腦損傷的一條重要途徑。長(zhǎng)時(shí)間癲癇發(fā)作后可出現(xiàn)腦內(nèi)選擇性的神經(jīng)元凋亡壞死和海馬硬化。通過腹腔注射戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）建立癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型來觀察癲癇大鼠海馬的組織學(xué)改變，并運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)

2、（RT-PCR）、western Blot以及免疫組織化學(xué)等方法觀察其海馬凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）的表達(dá)變化，探討癲癇發(fā)作后AIF介導(dǎo)的凋亡相關(guān)途徑，將有助于從分子水平上更有效的尋求癲癇的治療靶點(diǎn)，為減輕癲癇致腦損傷提供新途徑。
　　 方法：選取清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，實(shí)驗(yàn)起始質(zhì)量（200±20）g，12 h光亮/黑暗條件、22℃～25℃環(huán)境溫

3、度，分籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為癲癇持續(xù)狀態(tài)組（status epilepticus，SE組）和對(duì)照組（normal control group，NC組）兩個(gè)大組，每組又分為6，12，24，48小時(shí)四個(gè)亞組，每組動(dòng)物20只。SE各組大鼠應(yīng)用生理鹽水溶解的1％戊四氮溶液，首先按40 mg/kg腹腔注射，10min后20mg/kg注射，然后每10min注射10mg/kg，依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將大鼠行為分為6級(jí)。0級(jí)：無任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：胡須

4、動(dòng)、面肌抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭、咀嚼或濕狗樣抖動(dòng)（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢抬起、陣攣；Ⅳ級(jí)：站立伴有雙側(cè)前肢陣攣；Ⅴ級(jí)：跌倒、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作。完全點(diǎn)燃的標(biāo)準(zhǔn)是獲得連續(xù)3次Ⅳ級(jí)或以上的運(yùn)動(dòng)驚厥，且重復(fù)的SE發(fā)作達(dá)30min以上。對(duì)照組注射同等容量的生理鹽水。然后觀察大鼠行為學(xué)改變，各組大鼠均取4只分別選取6，12，24，48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察其組織學(xué)變化，并運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western

5、Blot方法分別測(cè)定大鼠海馬AIF mRNA和海馬胞核AIF蛋白的水平變化，用免疫組織化學(xué)方法觀察AIF在海馬CA1區(qū)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.動(dòng)物模型制備。SE組大鼠共80只，16只應(yīng)用40mg/kg、48只60 mg/kg、11只70 mg/kg、5只80mg/kg PTZ即開始出現(xiàn)驚厥，主要表現(xiàn)為節(jié)律性縮頭、肌陣攣。隨著PTZ每10min注射一次，很快出現(xiàn)四肢抽搐，進(jìn)入全面性強(qiáng)直發(fā)作階段的大鼠失去姿勢(shì)控

6、制，前、后肢伸肌強(qiáng)烈收縮，并伴有呼吸抑制，口周發(fā)紺，眼球充血，持續(xù)數(shù)分鐘不等。強(qiáng)直階段過后出現(xiàn)全面性強(qiáng)直一陣攣發(fā)作。80％動(dòng)物達(dá)到RacineⅣ～Ⅴ級(jí)的點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，大鼠SE持續(xù)時(shí)間在30 min以上。27只大鼠因持續(xù)強(qiáng)直發(fā)作而死亡，死亡率為33.8％。NC組動(dòng)物均無行為學(xué)改變。
　　 2.大鼠海馬組織學(xué)改變。對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊緊密，胞漿透明，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，形態(tài)接近正常；SE后

7、神經(jīng)元數(shù)目減少，排列散亂、胞體皺縮、胞漿紅染及胞核固縮，以SE后24h最明顯，6h和48h腦損傷較輕。
　　 3.大鼠海馬AIF mRNA的表達(dá)。SE后6h AIF mRNA表達(dá)開始增高（P<0.05與對(duì)照組相比），24h達(dá)高峰（P<0.01），48h表達(dá)略有下降，但仍高于對(duì)照組水平（P<0.05）。
　　 4.大鼠海馬細(xì)胞核中AIF的表達(dá)變化。正常對(duì)照組細(xì)胞核中少量AIF表達(dá)，在SE組，胞核中AIF蛋白表達(dá)水平在SE后

8、12h開始升高（P<0.05與對(duì)照組相比），24h達(dá)高峰（P<0.05），4811略有下降。
　　 5.AIF在海馬CA1區(qū)的表達(dá)情況。對(duì)照組可見AIF大多在海馬神經(jīng)元胞漿中呈現(xiàn)散在著色，SE后12h AIF在海馬神經(jīng)細(xì)胞核著色開始增多，陽性細(xì)胞率（P<0.05與對(duì)照組比較），并隨時(shí)間的延長(zhǎng)AIF陽性細(xì)胞率升高在SE后24h達(dá)高峰，且可見細(xì)胞數(shù)目減少，排列散亂。SE后48h略有下降但仍高于對(duì)照組（P<0.05）。