α-硫辛酸對(duì)杏仁核電點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬CaMKIIa表達(dá)的影響.pdf

1、目的:癲癇是指神經(jīng)元自發(fā)的，反復(fù)的，刻板的放電發(fā)作。癲癇可以導(dǎo)致認(rèn)知、情感、行為方面異常。癲癇病灶部位、發(fā)作類型及社會(huì)心理因素均可影響認(rèn)知，近幾年研究發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥物本身也有導(dǎo)致認(rèn)知損傷的副作用。氧化應(yīng)激參與了許多神經(jīng)變性疾病的生理病理過(guò)程，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激同樣存在于癲癇的發(fā)病機(jī)制之中。癲癇發(fā)作過(guò)程伴有氧自由基生成增多，大腦是脂質(zhì)過(guò)氧化物敏感的器官，其中海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷是癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。α-硫辛酸(

2、α-LipoicacidALA)是一種體內(nèi)強(qiáng)抗氧化劑，具有潛在的預(yù)防和治療癲癇所致認(rèn)知功能障礙的作用。目前α-硫辛酸多用于用來(lái)預(yù)防甚至治療某些疾病如:糖尿病及其并發(fā)癥、神經(jīng)系統(tǒng)退化及肝功能失調(diào)等癥狀。而α-硫辛酸在改善癲癇所致的認(rèn)知障礙中的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立杏仁核電點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型，并給予α-硫辛酸干預(yù)，用WesternBlot方法觀察鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(calciurn/calmodulindependent

3、proteinkinaseⅡa，CaMKⅡa)及磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)蛋白在海馬組織中的表達(dá)水平，用免疫組織化學(xué)方法觀察磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)在大鼠海馬組織中的蛋白表達(dá)水平及分布情況，用Nissl染色方法觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)情況，并用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。初步探討α-硫辛酸對(duì)癲癇認(rèn)知障礙有無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:將72只7-

4、8周，體重250-300g之間，成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(NC組)、假手術(shù)組（S組）、癲癇組（E組）、正常α-硫辛酸組(ALA組)、α-硫辛酸低劑量組（20mg/kgALA+E組）和α-硫辛酸高劑量組（40mg/kgALA+E組），每組各12只大鼠。正常對(duì)照組:不做任何處理;假手術(shù)組:杏仁核植入電極;癲癇組:杏仁核植入電極后每天按120％發(fā)作閾值刺激一次;正常α-硫辛酸組:不做任何處理的大鼠硫辛酸按40mg/kg腹腔

5、注射;α-硫辛酸低劑量組和α-硫辛酸高劑量組:于每天上午08:30-09:30之間分別腹腔注射α-硫辛酸20mg/kg和α-硫辛酸40mg/kg，藥物注射完30min后，按120％發(fā)作閾值刺激1次/日，共15次。結(jié)束后觀察1小時(shí)。依據(jù)Becker等改良的Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察:0級(jí):無(wú)任何反應(yīng)，呈正常的行為狀態(tài);1級(jí):濕狗樣抖動(dòng)、面肌痙攣如眨眼、動(dòng)須及節(jié)律性咀嚼;2級(jí):頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點(diǎn)頭和（或）甩尾;3級(jí):一側(cè)前肢陣攣;4級(jí):雙側(cè)

6、前肢陣攣伴站立;5級(jí):全身陣攣，失去平衡，跌倒。連續(xù)3次獲得Ⅳ級(jí)或Ⅳ級(jí)以上的運(yùn)動(dòng)性驚厥的大鼠為完全點(diǎn)燃。最后一次給藥結(jié)束后24小時(shí)，行Morris水迷宮檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)前1天大鼠在水池內(nèi)自由游泳2min，熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)包括(1)可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn):為排除實(shí)驗(yàn)處理因素對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感覺、視覺、知覺及運(yùn)動(dòng)功能的差異對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響，采用可視平臺(tái)對(duì)大鼠進(jìn)行測(cè)試。平臺(tái)升至液面上2cm，每只大鼠釋放4次，分別從不同的4個(gè)入水點(diǎn)入水，記錄大鼠的逃避潛伏期。(2

7、)定位航行實(shí)驗(yàn):用于測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力。正式實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天。以后4天每天分上、下午兩個(gè)時(shí)間段，每段訓(xùn)練4次，中間間隔＞2h。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選取一個(gè)象限中心作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁輕輕放入水中，每個(gè)時(shí)間段4次訓(xùn)練分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水。記錄大鼠從入水到爬上水下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。如120s大鼠仍未找到平臺(tái)，由操作者將大鼠引上平臺(tái)休息30s，并將潛伏期記錄為120s，兩次訓(xùn)練中間間隔60s;(3)空間探索實(shí)驗(yàn):用于測(cè)試大鼠的空間記憶能

8、力。定位航行實(shí)驗(yàn)完畢的第二天，將平臺(tái)撤除，選定和平臺(tái)區(qū)域相對(duì)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn)，記錄大鼠在120s內(nèi)為搜尋平臺(tái)而穿越平臺(tái)的次數(shù)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后:(1)每組各取6只大鼠灌注取腦，Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及損傷情況。同時(shí)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P-CaMKⅡa在海馬CA1區(qū)的表達(dá)情況;(2)每組另取6只大鼠，斷頭取腦，快速分離海馬，用Westerblot方法檢測(cè)海馬CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白水平變化。
　　結(jié)果

9、:
　　1、水迷宮結(jié)果:可視平臺(tái)試驗(yàn):NC組、ALA組、S組、E組大鼠、20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組之間比較逃避潛伏期無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　定位航行實(shí)驗(yàn):以各組大鼠每日逃避潛伏期均值進(jìn)行比較。(1)第1天，E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比有所延長(zhǎng);與E組相比，20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短，但各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞

10、0.05）。(2)第2天，各組大鼠逃避潛伏期均比第1天明顯縮短（P＜0.05）;E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）;與E組相比，20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短（P＜0.05），但與NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(3)第3天，各組大鼠逃避潛伏期均比第2天明顯縮短(P＜0.05);NC組、E組、20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組

11、、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結(jié)果與第2天相同。(3)第4天，各組大鼠逃避潛伏期均比第3天又有明顯縮短(P＜0.05);NC組、E組、20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結(jié)果與第3天相同。
　　空間探索試驗(yàn):E組大鼠與NC組大鼠相比，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(p＜0.05);與E組相比，20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(p＜0.05)

12、，且與NC組、ALA組、S組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　2、Nissl染色結(jié)果:NC組、ALA組及S組大鼠的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，無(wú)明顯神經(jīng)元丟失;與NC組相比，E組大鼠海馬細(xì)胞皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體明顯減少，染色質(zhì)凝集成塊、核固縮、神經(jīng)元丟失明顯;20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，有少量染色質(zhì)凝集，胞漿內(nèi)尼氏小體較E組顯著增加，僅

13、少量神經(jīng)元丟失。
　　3、免疫組化結(jié)果:P-CaMKⅡa蛋白在海馬組織中的陽(yáng)性細(xì)胞顯示為棕褐色，主要在細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)。E組的P-CaMKⅡa在海馬表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較NC組明顯降低（P＜0.05）。與E組比較，20mg/kgALA+E組和40mg/kgALA+E組的P-CaMKⅡa蛋白在海馬表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05）。且20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組與NC組、ALA組、S組之間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、差異（P＞0.05）。
　　4、Westernblot檢測(cè)結(jié)果:CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達(dá)水平以CaMKⅡa/GAPDH表示。E組CaMKⅡa蛋白表達(dá)水平較NC組明顯降低(P＜0.05)。20mg/kgALA+E組和40mg/kgALA+E組的CaMKⅡa蛋白表達(dá)水平較E組明顯升高（P＜0.05）。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

15、>　　P-CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達(dá)水平以P-CaMKⅡa/GAPDH表示。E組P-CaMKⅡa蛋白表達(dá)水平較NC組明顯降低（P＜0.05）。20mg/kALA+E組和40mg/kgALA+E組的P-CaMKⅡa蛋白表達(dá)水平較E組明顯升高（P＜0.05）。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)采用杏仁核電點(diǎn)燃

16、慢性癲癇大鼠模型可以很好地模擬人類癲癇后認(rèn)知功能障礙，是研究癲癇后認(rèn)知障礙的理想模型。
　　2、癲癇可導(dǎo)致CaMKⅡa和P-CaMKⅡa蛋白表達(dá)下降，并導(dǎo)致腦組織受損，提示CaMKⅡa及P-CaMKⅡa可能與癲癇后認(rèn)知障礙相關(guān)。
　　3、α-硫辛酸可以上調(diào)癲癇后海馬組織中CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白的表達(dá)水平，改善癲癇后認(rèn)知障礙，并減輕腦組織的損害，提示α-硫辛酸可改善癲癇后認(rèn)知障礙并對(duì)腦組織有一定保護(hù)作用，這種作用可