自噬在熊果酸抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、目的：研究自噬在熊果酸(Ursolic acid，UA)抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVECs，采用不同濃度的熊果酸和自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methylladenine，3-MA)與熊果酸聯(lián)合處理。運(yùn)用MTT法檢測(cè)熊果酸對(duì)HUVECs增殖的抑制作用及其聯(lián)合3-MA處理細(xì)胞后細(xì)胞存活狀態(tài)的變化；

2、在透射電鏡下觀察熊果酸作用前后HUVECs結(jié)構(gòu)的改變；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果酸對(duì)HUVECs自噬水平的影響；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)熒光染色法觀察熊果酸對(duì)HUVECs自噬泡的影響；Western blotting檢測(cè)LC3及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1蛋白的表達(dá)情況；

3、RT-PCR檢測(cè)LC3及Beclin-1轉(zhuǎn)錄水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs經(jīng)熊果酸和3-MA與熊果酸聯(lián)合處理后凋亡率的變化。
　　結(jié)果：隨著熊果酸作用于HUVECs劑量的增加細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度及死亡程度也逐漸的增強(qiáng)；熊果酸抑制HUVECs生長(zhǎng)增值36h的半數(shù)作用劑量為201mnol/L；HUVECs經(jīng)熊果酸處理后透射電鏡及MDC染色均顯示：細(xì)胞漿中自噬相關(guān)形態(tài)的數(shù)量具有明顯上升的趨勢(shì)；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)顯示熊果酸處理HUV

4、ECs組LC3陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示熊果酸處理HUVECs后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與正常細(xì)胞培養(yǎng)組相比明顯增強(qiáng)；HUVECs經(jīng)熊果酸處理后可上調(diào)LC3及Beclin-1的蛋白水平及mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；3-MA與熊果酸聯(lián)合作用后，HUVECs受到的增殖抑制明顯高于熊果酸單獨(dú)作用，且其凋亡率上升明顯。
　　結(jié)論：熊果酸抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，在這個(gè)過程中自噬現(xiàn)象被激活，自噬在此過程中對(duì)HUVECs起保護(hù)作用。