嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌金屬蛋白酶的分離純化、理化活性研究與基因克隆.pdf

1、蛋白水解酶(proteolytic enzyme)有時(shí)也稱為蛋白酶(protease)，是指用于切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，使蛋白質(zhì)分子變成小分子多肽或氨基酸的內(nèi)切(肽)酶，蛋白水解酶在工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用，是目前醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用最廣的一類酶。金屬蛋白酶(Metalloprotease)是活性中心依賴于金屬離子的一類蛋白酶。大多數(shù)金屬蛋白酶是Zn2+金屬蛋白酶，金屬蛋白酶分布廣泛，性質(zhì)特異，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前主要應(yīng)用于食品、

2、洗滌劑、化妝品、殺蟲(chóng)劑及抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和疾病的機(jī)理研究等方面。由于金屬蛋白酶來(lái)源有限，限制了金屬蛋白酶的進(jìn)一步發(fā)展，所以研究微生物金屬蛋白酶，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)金屬蛋白酶具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。 嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)是本試驗(yàn)室從昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)崇明擬異小桿線蟲(chóng)(Heterorhabditidoides chongmingensis)的腸道中分離到的1個(gè)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌新種。本試驗(yàn)從Serra

3、tia nematodiphila的D20503SB1的菌體發(fā)酵液中分離純化得到一種金屬蛋白酶，屬于鋅離子金屬蛋白酶。經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾、DEAE-Sepharcyl Fast Flow離子交換層析、Resource Q中壓液相層析分離得到電泳純的蛋白。通過(guò)還原與非還原SDS-PAGE電泳表明該蛋白為單鏈分子，相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kDa。 該菌能在以酪蛋白為底物的蛋白酶檢測(cè)固體培養(yǎng)基上形成明顯的水解暈圈，證明

4、該菌株具有較強(qiáng)的蛋白酶水解酶活力。通過(guò)酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，純化的蛋白具有酪蛋白水解酶活性。同時(shí)，通過(guò)分析用Edman降解法得到的N-端15個(gè)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens SM6和粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens E15以及粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens HR-3的金屬蛋白酶N-端15個(gè)氨基酸序列具有較高的相似性，進(jìn)一步證明了該蛋白是金屬蛋白酶。根據(jù)N-端

5、測(cè)序結(jié)果和同源性分析設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到1500 bp左右的產(chǎn)物，然后插入到PMD18-T載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，對(duì)得到的陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)1398 bp，編碼465個(gè)氨基酸殘基。分析發(fā)現(xiàn)克隆翻譯得到氨基酸序列與N-末端測(cè)序結(jié)果相吻合，得到一個(gè)完整的成熟肽序列。該基因序列與報(bào)道的粘質(zhì)沙雷氏菌SM6菌株的金屬蛋白酶基因的同源性達(dá)到98％，與沙雷氏菌HR-3菌株金屬蛋白酶基因的的同源性也達(dá)到97％，推導(dǎo)

6、的成熟肽氨基酸序列與粘質(zhì)沙雷氏菌SM6菌株和沙雷氏菌HR-3菌株的金屬蛋白酶成熟肽同源性都達(dá)到98％。該成熟肽片段包括470個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為pI4.57，相對(duì)分子質(zhì)量為50642.92Da。 通過(guò)研究證實(shí)：該菌株在LB培養(yǎng)基和加有酪蛋白的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中分泌的胞外蛋白酶活力在對(duì)數(shù)期隨著細(xì)菌濃度的增大不斷增強(qiáng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期約30 h蛋白酶活性達(dá)到最大，而該菌株在無(wú)蛋白質(zhì)和氨基酸的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 h都未檢測(cè)到胞外蛋

7、白酶活性物質(zhì)。通過(guò)Serratia nematodiphila在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的比較確定該菌株分泌的胞外蛋白酶為誘導(dǎo)型表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證明了該蛋白是金屬蛋白酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了純化的金屬蛋白酶的一些酶學(xué)性質(zhì)。動(dòng)力學(xué)方法測(cè)得該金屬蛋白酶能適應(yīng)較寬的pH值范圍，該酶在6.0-11.0的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適pH值為8.0，該酶在43℃以下的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度35℃。以酪蛋白為底物的Km值為6.10 mg/mL。該

8、酶對(duì)各種有機(jī)溶劑都有較強(qiáng)的耐受性，但甲醛對(duì)酶活性的影響較大，對(duì)非離子表面活性劑敏感。 Zn2+、Cu2+離子對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用；Nj2+，Mg2+，Co2+，Ba2+，F(xiàn)e3+等金屬離子在低濃度時(shí)對(duì)酶的活性有不同程度的促進(jìn)作用。相對(duì)看來(lái)各種濃度的Mg2+、Ca2+和Fe2+對(duì)酶活力的影響較小，高濃度時(shí)各種離子對(duì)酶的活力都有抑制作用。20 mM的金屬離子螯合劑EDTA和3 mM1，10鄰氮二菲都對(duì)蛋白酶活力有較大程度的

9、抑制作用(抑制50％以上)，Cu2+，Co2+，Zn2+，Mn2+，Ni2+，Mg2+等離子對(duì)EDTA抑制了的酶活力有不同程度的恢復(fù)作用，尤其是Mg2+使被EDTA抑制了的酶活力恢復(fù)了84.2％，Ca2+，Cu2+，Co2+，Mg2+，Zn2+，Mn2+，Nj2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+等離子對(duì)1，10鄰氮二菲抑制了的酶活力有不同程度的恢復(fù)作用，尤其是Fe2+使酶活力恢復(fù)了74.5％。這說(shuō)明金屬離子對(duì)于維持該酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而保持其酶活力