藍(lán)圓鲹肌肉金屬蛋白酶的分離純化及對(duì)膠原蛋白的作用.pdf

1、金屬蛋白酶(Metalloproteinase)是一類活性中心含有金屬離子的蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的最重要的金屬離子依賴性蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs參與魚死后肌肉軟化過程中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解。迄今為止，國(guó)內(nèi)外海水魚肌肉中基質(zhì)金屬蛋白酶的研究大多停留在基因水平上，在蛋白水平上的研究報(bào)道較少。本文以海水魚

2、藍(lán)圓鲹（Decapterusmaruadsi）為研究對(duì)象，對(duì)肌肉中降解膠原蛋白的酶進(jìn)行研究，探討金屬蛋白酶對(duì)膠原蛋白的作用。
　　利用明膠酶譜法，在藍(lán)圓鲹肌肉中發(fā)現(xiàn)了一種能夠分解膠原蛋白的金屬蛋白酶。通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析和Gelatin-Sepharose親和層析，分離純化了金屬蛋白酶，其在SDS-PAGE電泳上顯示為分子量分別約為57 kDa和55 k

3、Da的兩個(gè)條帶。性質(zhì)分析表明，該金屬蛋白酶在弱堿性條件下顯示活性，最適溫度為40℃，最適pH為8.0，金屬蛋白酶抑制劑(EDTA、EGTA、1，10phenanthroline等)對(duì)其具有強(qiáng)烈的抑制作用。金屬離子Ca2+、Ba2+和Zn2+對(duì)其有激活作用，其中Ca2+的激活作用最大。
　　同時(shí)，通過堿抽提、醋酸溶解以及氯化鈉分步鹽析等方法，從鯉魚肌肉中分別純化了Ⅰ型和Ⅴ型膠原蛋白。對(duì)Ⅴ型膠原蛋白進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析，從α2鏈中得

4、到8個(gè)有效肽段共130個(gè)氨基酸殘基，與斑馬魚Ⅴ型膠原蛋白α2鏈的序列完全一致，證明純化的蛋白為Ⅴ型膠原蛋白。將其作為抗原免疫新西蘭大白兔，成功制備其多克隆抗體，采用免疫印跡法對(duì)抗Ⅴ型膠原蛋白多克隆抗體進(jìn)行特異性分析，發(fā)現(xiàn)其特異性較好。利用圓二色譜分別對(duì)兩種膠原蛋白進(jìn)行熱變性溫度分析，Ⅰ型膠原蛋白的熱變性溫度為28.5℃，Ⅴ型膠原蛋白為30.5℃。以這兩種膠原蛋白為底物，分析金屬蛋白酶對(duì)這兩種膠原蛋白的降解能力。發(fā)現(xiàn)該酶在37℃和4℃均能