抗乙型肝炎病毒聚合酶、核心抗原的單克隆抗體制備及其功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒感染是目前全世界面臨的一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)超過(guò)20億人已經(jīng)感染了乙肝病毒，其中約3.5億人患有慢性HBV感染。由于HBV感染的高患病率和因慢性乙肝導(dǎo)致的肝癌高死亡率，乙肝因此對(duì)我國(guó)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。到目前為止，主要有兩大類(lèi)被FDA批準(zhǔn)的用于抗HBV藥物，免疫調(diào)節(jié)劑（IFN-α和PEG-IFN-α）和核苷（酸）的類(lèi)似物。然而，所有現(xiàn)有的治療方式，都不能完全消除 HBV。即使使用最好的抗病毒藥物，

2、血清學(xué)應(yīng)答也不理想，患者需長(zhǎng)期用藥，復(fù)發(fā)率高，費(fèi)用昂貴，此外長(zhǎng)期用藥幾乎均會(huì)出現(xiàn)耐藥。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，治療性單克隆抗體藥物概念及技術(shù)日漸成熟，在腫瘤及自身免疫病方面已經(jīng)取得了較好的成果。目前，對(duì)于HBV的抗病毒治療的研究，主要集中于小分子藥物，尚沒(méi)有治療乙肝的抗體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。傳統(tǒng)上認(rèn)為抗體只能針對(duì)胞外靶標(biāo)，然而隨著近幾年技術(shù)進(jìn)步，胞內(nèi)抗體研究受到了廣泛的關(guān)注及快速的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)抗體經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入細(xì)胞也可以作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)并又

3、不同于胞外的作用機(jī)制。一般認(rèn)為，胞內(nèi)抗體主要通過(guò)與抗原形成抗原抗體復(fù)合物，從而直接阻斷靶標(biāo)蛋白發(fā)揮功能，或者影響其亞細(xì)胞定位或分泌過(guò)程但？抗體入胞方式。廈門(mén)大學(xué)張軍方博士用穿膜肽攜帶抗體入胞的方式發(fā)現(xiàn)針對(duì)HBX蛋白胞內(nèi)抗體具有抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)抗病毒作用是通過(guò)形成抗原抗體結(jié)合物后進(jìn)一步通過(guò)Trim21蛋白介導(dǎo)的蛋白降解實(shí)現(xiàn)的。該研究啟發(fā)我們，雖然 HBx在增強(qiáng) HBV復(fù)制及促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著重要的作用，但并不是病毒復(fù)制周期必須的

4、蛋白。HBV感染胞內(nèi)蛋白還有HBVpoL蛋白和HBc蛋白。這兩個(gè)蛋白在病毒復(fù)制周期中都是必須的，具有多種必不可少的功能。如果能在胞內(nèi)抑制這兩種蛋白的作用，理論上可以獲得更好的抗病毒效果，開(kāi)發(fā)針對(duì)HBV蛋白的胞內(nèi)抗體可能可以為治療HBV提供新思路。因此本研究以這兩種胞內(nèi)蛋白為靶點(diǎn)，篩選具有胞內(nèi)抗病毒作用的抗體。初步評(píng)估抗病毒作用效果、探討胞內(nèi)抗體的作用機(jī)制以及該類(lèi)型的抗體是否具備開(kāi)發(fā)為臨床藥物的潛力。
　　本研究分為三個(gè)部分：第一部

5、分成功原核了表達(dá)的HBVpol-aa1-aa192、HBVpol-aa159-aa406片段，表達(dá)量非常高，但都以包涵體的形式存在，且很難恢復(fù)為天然構(gòu)象，這可能與HBVpol富含含硫氨基酸有關(guān)。成功獲得了41株反應(yīng)性良好的單克隆細(xì)胞，并純化為濃度較高的抗體，為下一步研究擴(kuò)增了抗體庫(kù)。成功獲得了能與真核系統(tǒng)表達(dá)的HBVpol全長(zhǎng)反應(yīng)的抗體，既有可以和wb反應(yīng)的抗體，也有免疫熒光反應(yīng)性,其中一株抗體P20是目前全世界唯一一株適合用于HBV細(xì)

6、胞株中聚合酶WB檢測(cè)的抗體。為下一步的研究提供了工具。并且建立了可以檢測(cè)細(xì)胞裂解液中HBVpol雙抗體夾心的配對(duì)抗體。繼續(xù)優(yōu)化后可嘗試檢測(cè)血清中HBVpol蛋白。第二部分在轉(zhuǎn)基因小鼠上驗(yàn)證了HBVpol單抗抗病毒作用，結(jié)果提示幾株抗體具有較好的降低HBV-DNA的效果，最好的一株抗體可以降低小鼠血清滴度約10倍。為了繼續(xù)驗(yàn)證HBVpol單抗抗病毒效果并研究其機(jī)制，構(gòu)建真核表達(dá)載體的重組HBVpol單抗。在共轉(zhuǎn)染huh7細(xì)胞模型中、HBV

7、穩(wěn)定整合細(xì)胞株模型中、 hepaG2-NTCP感染模型中繼續(xù)驗(yàn)證重組表達(dá)抗體的抗病毒作用。結(jié)果顯示各種細(xì)胞模型中均對(duì)HBeAg水平有比較理想的降低作用.提示這株單抗在細(xì)胞內(nèi)也具有很好的抗病毒的作用。為了探究HBVpol單抗抗病毒作用機(jī)制，我們觀察了一些細(xì)胞內(nèi)固有信號(hào)通路的重要分子，發(fā)現(xiàn)NFκB、AP-1、IRSE、IFN-β均被激活。用基因敲除的辦法證明胞內(nèi) Anti-HBVpol單抗發(fā)揮作用主要依賴(lài)TRIM21分子。第三部分篩選獲得由