馬利筋新型C21甾體化合物Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：P-glycoprotein（P-gp）介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）是目前導(dǎo)致臨床藥物治療腫瘤失敗的一個(gè)重要原因。以P-gp為代表的ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)ATP水解釋能將不同類型及作用機(jī)理的抗腫瘤藥物外排至細(xì)胞外，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度急劇下降，達(dá)不到治療閥值，最終形成腫瘤多藥耐藥。目前，攻克P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥最為理想有效的方法是通過(guò)外源性化合物干擾P-gp在耐藥腫瘤組織中

2、的表達(dá)水平或者抑制其外排抗腫瘤藥物的功能，從而恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)于相應(yīng)抗腫瘤藥物的敏感性，此類的干預(yù)措施稱為P-gp抑制劑或者逆轉(zhuǎn)耐藥劑。自從第一代P-gp抑制劑維拉帕米（VRP）和環(huán)孢菌素A（CsA）被開(kāi)發(fā)以來(lái)，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和來(lái)源的化合物相繼被證實(shí)具有逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的作用，其中有不少候選化合物進(jìn)入臨床前以及臨床研究。但相關(guān)臨床前及臨床試驗(yàn)研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)的候選逆轉(zhuǎn)耐藥劑在干預(yù)腫瘤多藥耐藥過(guò)程中存在著明顯的臟器毒性以

3、及改變相關(guān)抗腫瘤藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征等副作用，限制了其進(jìn)入臨床使用。因此，目前還沒(méi)有一個(gè)成熟的P-gp抑制劑通過(guò)臨床試驗(yàn)III期研究，應(yīng)用于克服腫瘤多藥耐藥。
　　天然產(chǎn)物因其結(jié)構(gòu)多樣性以及新穎性，常作為新一代高效、低毒P-gp抑制劑的候選化合物來(lái)源。隨著天然產(chǎn)物分離以及結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多具有較低副作用和良好耐受性的天然中藥提取分離產(chǎn)物被報(bào)道證實(shí)具有體內(nèi)體外逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的作用。目前，研究報(bào)道具有逆轉(zhuǎn)活性

4、的天然來(lái)源化合物主要為黃芩素及其衍生物、色胺酮類、生物堿類、生物萜類類等。在2015年，許多研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道化學(xué)合成的強(qiáng)心甾類化合物具有體外逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的活性。為了拓展天然產(chǎn)物來(lái)源P-gp抑制劑的研究領(lǐng)域，課題組前期對(duì)天然蘿藦科植物馬利筋（Asclepias curassavia）提取分離得到的一系列強(qiáng)心甾類及C21甾體類化合物的逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥活性進(jìn)行篩選，初步發(fā)現(xiàn)C21甾體類化合物Asclepiasterol

5、具有明顯抑制P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的活性?；诖?，本研究在進(jìn)一步確證Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥活性的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)解析其內(nèi)在的作用機(jī)制和相關(guān)作用靶點(diǎn)，以期為該新型候選化合物的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　研究方法：本研究主要從P-gp藥物外排功能、P-gp在耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平以及P耐藥腫瘤細(xì)胞中P-gp轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)作用點(diǎn)三個(gè)層次考察Asclepiasterol逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐

6、藥的作用及其機(jī)制：
　　1.采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Asclepiasterol對(duì)相關(guān)耐藥腫瘤細(xì)胞（MCF-7/ADR、HepG-2/ADM、K562/ADR及K562/ADM）及其相應(yīng)母源敏感細(xì)胞（MCF-7、HepG-2及K562）、非腫瘤細(xì)胞HEK293、LO2和Chang等細(xì)胞增殖的影響，從而確定考察逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的最佳濃度；
　　2.采用MTT實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Asclepiasterol是否增強(qiáng)P-gp陽(yáng)性表達(dá)

7、腫瘤細(xì)胞對(duì)相應(yīng)抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素以及紫杉醇敏感性；
　　3.采用AnnexinV/PI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Asclepiasterol對(duì)紫杉醇所介導(dǎo)的耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡狀況的影響；
　　4.采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿霉素聯(lián)合使用Asclepiasterol對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響；
　　5.采用Western Blotting實(shí)驗(yàn)和Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Asclepiasterol對(duì)耐藥腫瘤細(xì)

8、胞蛋白表達(dá)和相關(guān)基因表達(dá)的影響；
　　6.采用P-gp ATPase systems試劑盒檢測(cè)Asclepiasterol對(duì)P-gp外排底物功能的影響。
　　7.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Asclepiasterol干預(yù)之后，P-gp特異性熒光底物和阿霉素在耐藥腫瘤細(xì)胞中蓄積情況的變化；
　　8.采用基因沉默技術(shù)和相關(guān)蛋白抑制劑及激動(dòng)劑干預(yù)考察相應(yīng)蛋白靶點(diǎn)與P-gp在耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的相互作用；
　　9.采用免疫共沉淀

9、技術(shù)考察Asclepiasterol對(duì)P-gp在耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)泛素化降解的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Asclepiasterol在最高濃度10.0μM處理模式耐藥腫瘤細(xì)胞MCF-7/ADR、HepG-2/ADM、K562/ADR及K562/ADM、野生型敏感腫瘤細(xì)胞MCF-7、HepG-2和K562以及非腫瘤細(xì)胞HEK293、LO2、Chang細(xì)胞48h后沒(méi)有顯現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，并且模式耐藥腫瘤

10、細(xì)胞及其野生型敏感腫瘤細(xì)胞在5.0μM Asclepiasterol干預(yù)下，細(xì)胞存活率均為95％左右。
　　2.P-gp陽(yáng)性表達(dá)的模式耐藥腫瘤細(xì)胞在沒(méi)有明顯細(xì)胞毒性濃度的Asclepiasterol（2.5和5.0μM）干預(yù)下，恢復(fù)了對(duì)其相應(yīng)外排底物抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素及紫杉醇的敏感性。
　　3.Asclepiasterol增強(qiáng)P-gp底物抗腫瘤藥物紫杉醇誘導(dǎo)模式耐藥腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用；Asclepias

11、terol與阿霉素 Dox聯(lián)合使用處理模式耐藥腫瘤細(xì)胞可以顯著性地降低其惡性增殖的能力。
　　4.Asclepiasterol增強(qiáng)模式耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)P-gp特異性熒光底物Rh123和阿霉素Dox的蓄積作用。
　　5.Asclepiasterol在沒(méi)有影響模式耐藥腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因ABCB1/MDR1表達(dá)的前提下，顯著性地下調(diào)了多藥耐藥蛋白P-gp在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　6.Asclepiasterol在短期（

12、4h）處理模式耐藥腫瘤細(xì)胞后能夠影響Rh123在耐藥細(xì)胞中的蓄積水平，P-gp ATPase實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Asclepiasterol在短期內(nèi)影響P-gp ATPase酶的活性，抑制其催化ATP水解的作用。
　　7. Asclepiasterol影響原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1在模式耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過(guò)基因沉默技術(shù)以及相關(guān)蛋白抑制劑干擾Pim-1在模式耐藥腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)P-gp的表達(dá)水平也明顯受到抑制。<

13、br>　　8. Asclepiasterol抑制P-gp與Pim-1的結(jié)合能力，從而影響了Pim-1增強(qiáng)P-gp在細(xì)胞膜上穩(wěn)定性的能力。
　　9.細(xì)胞信號(hào)通路MAPK/ERK在模式耐藥細(xì)胞中處于活化狀態(tài)，Asclepiasterol能夠顯著性地抑制該細(xì)胞信號(hào)通路的活性；MAPK/ERK通路抑制劑U0126-EtOH能夠抑制該通路關(guān)鍵蛋白P-ERK，并且介導(dǎo)下調(diào)P-gp在模式耐藥腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平；MAPK/ERK通路激動(dòng)劑表皮生

14、長(zhǎng)因子EGF可以逆轉(zhuǎn)Asclepiasterol介導(dǎo)抑制P-ERK及P-gp表達(dá)的作用。
　　10. Asclepiasterol激活了P-gp在模式耐藥腫瘤細(xì)胞中泛素-蛋白酶體化蛋白降解通路，從而導(dǎo)致P-gp在耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平的減少；泛素-蛋白酶體化通路抑制劑MG-132能夠顯著性地抑制Asclepiasterol所介導(dǎo)的增強(qiáng)P-gp泛素化降解的作用。
　　研究結(jié)論：
　　1.Asclepiasterol能夠有效逆

15、轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥；
　　2.Asclepiasterol通過(guò)短期抑制P-gp外排功能和長(zhǎng)期抑制P-gp蛋白表達(dá)兩方面的作用發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的作用；
　　3.Asclepiasterol通過(guò)原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1、絲裂原活化蛋白激酶細(xì)胞信號(hào)通路MAPK/ERK以及泛素-蛋白酶體蛋白降解系統(tǒng)參與調(diào)控P-gp在模式耐藥腫瘤細(xì)胞中的功能與表達(dá)水平。
　　3.Asclepiast