甾體化合物ASC26對(duì)ABCB1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、多藥耐藥性的產(chǎn)生，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要因素。研究報(bào)道ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員之一的ABCB1，是最早發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABCB1的過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一。尋找高效低毒的ABCB1選擇性抑制劑已成為科研工作者的研究熱點(diǎn)。本課題利用ABCB1過(guò)表達(dá)的腫瘤耐藥細(xì)胞株，對(duì)一系列甾體衍生物進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)耐藥活性研究，旨在篩選出高效低毒的ABCB1選擇性抑制劑，并研究其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制，為解

2、決腫瘤耐藥性問(wèn)題提供研究模型。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.以ABCB1過(guò)表達(dá)的結(jié)腸癌耐阿霉素SW620/Ad300細(xì)胞株為基礎(chǔ)，建立逆轉(zhuǎn)劑篩選平臺(tái)，采用MTT法對(duì)一系列甾體衍生物進(jìn)行篩選，旨在尋找高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。結(jié)果表明，新型甾體化合物ASC26在濃度為5μM時(shí)能顯著逆轉(zhuǎn)ABCB1調(diào)控的耐藥，并且對(duì)細(xì)胞的抑制率僅為7.39％。
　　2.利用MTT法評(píng)價(jià)ASC26對(duì)七對(duì)腫瘤耐藥及其親本細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASC2

3、6在8μM時(shí)，對(duì)這七對(duì)腫瘤耐藥及親本細(xì)胞的抑制率均小于15%，即沒(méi)有細(xì)胞毒性。
　　3.進(jìn)一步研究 ASC26在濃度為8μM時(shí)的體外逆轉(zhuǎn)耐藥活性。結(jié)果表明， ASC26能使高表達(dá)ABCB1的腫瘤耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇（ABCB1的底物）的敏感性顯著增加，而對(duì)順鉑（非ABCB1的底物）的抗腫瘤活性則無(wú)明顯影響。此外，對(duì)于ABCG2過(guò)表達(dá)的耐藥細(xì)胞，ASC26未表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。
　　4.利用高效液相法檢測(cè)ASC26對(duì)ABCB1高

4、表達(dá)的腫瘤耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞內(nèi)紫杉醇蓄積和外排的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASC26能顯著增加紫杉醇在ABCB1高表達(dá)的腫瘤耐藥細(xì)胞中的蓄積，抑制ABCB1高表達(dá)的腫瘤耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的外排，提高細(xì)胞內(nèi)紫杉醇含量，而對(duì)親本腫瘤細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的蓄積和外排無(wú)明顯作用。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ASC26對(duì)ABCB1高表達(dá)的SW620/Ad300細(xì)胞內(nèi)羅丹明（Rho123）蓄積的影響。結(jié)果表明，ASC26能顯著增加 SW620/Ad300細(xì)胞內(nèi)Rh

5、o123的滯留率，但對(duì)親本SW620細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積無(wú)明顯影響。
　　6.免疫熒光檢測(cè)ASC26對(duì)SW620/Ad300細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)位點(diǎn)的影響。ASC26作用于SW620/Ad300細(xì)胞72 h后，免疫熒光法檢測(cè)ASC26對(duì)ABCB1表達(dá)位點(diǎn)的作用。結(jié)果表明， ASC26不改變細(xì)胞內(nèi)ABCB1的蛋白表達(dá)位點(diǎn)。
　　8.利用Western blot檢測(cè)ASC26對(duì)ABCB1蛋白表達(dá)水平的影響。由West

6、ern blot結(jié)果可知， ASC26分別作用于SW620/Ad300耐藥細(xì)胞0 h，24 h，48 h，72 h后，并不改變細(xì)胞內(nèi)ABCB1的蛋白表達(dá)水平。
　　9.分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)研究ASC26與人同源ABCB1分子模型的相互作用關(guān)系。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明，化合物 ASC26能結(jié)合在 ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的藥物結(jié)合口袋上，從而抑制ABCB1對(duì)化療藥物的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　本課題發(fā)現(xiàn)了一個(gè)選擇性ABCB1抑制劑，新型甾體化合

7、物ASC26，在無(wú)毒濃度下，能顯著逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的腫瘤耐藥。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明， ASC26的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制是通過(guò)抑制 ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)泵的外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而不是通過(guò)影響ABCB1的蛋白表達(dá)來(lái)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用。ASC26能與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的藥物結(jié)合口袋結(jié)合，抑制ABCB1對(duì)抗腫瘤藥物的外排作用，增加細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物的濃度，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的效果。這一研究成果將為解決腫瘤耐藥性問(wèn)題提供新