腫瘤細(xì)胞多藥耐藥形成及逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：運(yùn)用化療藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)處理白血病細(xì)胞株K562，誘導(dǎo)獲得性耐藥的產(chǎn)生，檢測(cè)細(xì)胞耐藥、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，初步探討獲得性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制；研究環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)特異性抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)對(duì)乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，觀察Celecoxib對(duì)多藥耐藥基因mdrl及其相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，初步探討其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)制。

2、 方法： 1.K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度DOX分別作用不同時(shí)間后，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)各組細(xì)胞。mdrl及其編碼的P-糖蛋白(P-glycoproteln，P-gp)的表達(dá)水平，尋找DOX誘導(dǎo)獲得性耐藥的最佳作用時(shí)間和劑量。經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)獲得性耐藥K562細(xì)胞中TopoII、GST,MRP,NF-kappaB,YB-1等耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)情況；免

3、疫熒光染色方法檢測(cè)Survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度；Westernblot法檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞核內(nèi)NF-kappaB表達(dá)變化，評(píng)價(jià)其活化程度。 2.采用四唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)DOX敏感性，分析聯(lián)合應(yīng)用低劑量Celecoxib時(shí)DOX對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration，IC50)，計(jì)算增敏倍數(shù)；FCM觀察Celecoxib作用對(duì)細(xì)胞周期的影響，并檢測(cè)

4、P-gp蛋白表達(dá)水平，羅丹明外排實(shí)驗(yàn)測(cè)定P-gp蛋白功能；RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)耐藥相關(guān)調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.隨著DOX作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，mdr-1及P-gp的表達(dá)逐漸上調(diào)，DOX濃度為0.5 uM，作用時(shí)間為48h即能誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥；在獲得性耐藥細(xì)胞中MRP基因的表達(dá)亦上調(diào)，TopoII表達(dá)量下降，GST則無(wú)明顯變化，轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB和Y

5、B-1的表達(dá)亦上調(diào)；在耐藥誘導(dǎo)過(guò)程中，NF-kappaB蛋白呈劑量依賴性方式活化，NF-kappaB的活化可能與獲得性耐藥的產(chǎn)生有關(guān)；此外，凋亡抑制基因Survivin及其編碼蛋白的表達(dá)水平亦上調(diào)，表明細(xì)胞凋亡減少也是獲得性耐藥產(chǎn)生機(jī)制之一。 2.Celecoxlb對(duì)MCF-7/ADR的多藥耐藥具有明顯逆轉(zhuǎn)作用，10uM和20uM濃度的Celecoxib均可以明顯提高M(jìn)CF-7/ADR對(duì)DOX的敏感性，平均增敏倍數(shù)分別為1.81

6、和3.72倍；當(dāng)Celecoxib濃度為25uM作用24h后，與對(duì)照組相比，MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)量和功能均下降，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞顯著減少(P<0.05)，Celecoxib 50 u M與25 u M的作用相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；用RT-PCR方法可觀察到在Celecoxib作用下，mdrl、Survivin、VEGF、COX-2、YB-1、c-Jun等在基因和蛋白表達(dá)水平上均下調(diào)，尤以c-Jun

7、變化最為明顯，而NF-kappaB,Topo II基因表達(dá)無(wú)明顯變化。 結(jié)論： 1.DOX以劑量和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥，多種耐藥相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因Survivin共同參與獲得性耐藥的形成。 2.Celecoxib可逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR對(duì)DOX的耐藥作用；Celecoxib逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制可能是使耐藥細(xì)胞阻滯在G。期、降低VEGF表達(dá)水平、抑制抗凋亡蛋白Survivin及下調(diào)mdrl基因