VD在PC12細(xì)胞中對(duì)Cer的影響研究及補(bǔ)充VD前后EAE鼠血清中蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、背景:
　　多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)是一種伴隨著神經(jīng)細(xì)胞死亡，髓鞘脫落的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，患者常出現(xiàn)幻視及認(rèn)知障礙等臨床癥狀。MS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前大多數(shù)研究者認(rèn)為MS的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同影響的結(jié)果。MS的臨床治療藥物仍停留在免疫調(diào)節(jié)劑及免疫抑制劑階段，但均療效有限且存在嚴(yán)重的副作用。維生素D（Vitamin D，VD）作為人體內(nèi)必需的微量有機(jī)物質(zhì)，主要在調(diào)節(jié)人體內(nèi)的鈣穩(wěn)

2、態(tài)方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，VD在免疫系統(tǒng)疾病及癌癥治療方面的作用逐漸受到關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查顯示，MS發(fā)病率與光照有顯著相關(guān)性。光照可催化體內(nèi)VD合成，科學(xué)家們推測(cè)MS與VD具有相關(guān)性。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MS病人體內(nèi)，維生素D的含量明顯降低，且維生素D的缺乏可增加MS的患病風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)充維生素

3、D能顯著緩解模型動(dòng)物的EAE癥狀。目前關(guān)于維生素D緩解MS/EAE的作用研究已有些報(bào)道，但其具體作用機(jī)制仍不甚明確。因此，深入探討維生素D緩解MS/EAE作用機(jī)制，可為維生素D的臨床應(yīng)用提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　一，PC12細(xì)胞中維生素D對(duì)神經(jīng)酰胺的影響作用研究
　　鞘脂是一類參與到多種生物學(xué)功能和病理學(xué)過(guò)程中的脂類物質(zhì)。神經(jīng)酰胺(Ceramide，Cer)作為鞘脂類的中心代謝產(chǎn)物參與多種細(xì)胞活動(dòng)，

4、如細(xì)胞遷移，凋亡過(guò)程及炎癥反應(yīng)。短鏈神經(jīng)酰胺及內(nèi)源性神經(jīng)酰胺能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡，主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞核的破碎和核內(nèi)DNA的損傷。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠的脊髓內(nèi)，C16∶0-Cer的含量顯著升高，神經(jīng)酰胺合酶6的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這表明Cer與EAE/MS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本課題組的前期工作表明，維生素D能顯著降低EAE大鼠脊髓內(nèi)Cer下游代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine1-phospha

5、te，S1P)的含量并緩解EAE大鼠發(fā)病進(jìn)程，但是作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究利用PC12細(xì)胞，探討維生素D對(duì)神經(jīng)酰胺的影響作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為維生素D緩解MS/EAE的作用機(jī)制研究提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　闡明在PC12細(xì)胞中維生素D對(duì)神經(jīng)酰胺的影響作用。為VD治療MS的機(jī)制研究提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1，采用MTT法檢測(cè)C2-Cer(20，10，5，2.5，1.2

6、5，0.62，0μM)處理的PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性。
　　2，采用HPLC-MS的方法檢測(cè)維生素D（50nM和0nM）處理的PC12細(xì)胞中C16∶0-Cer的含量。
　　3，采用RT-PCR法檢測(cè)維生素D（50nM和0nM）處理的PC12細(xì)胞中神經(jīng)酰胺合成和代謝相關(guān)酶的含量。其中包括存在于脊髓中的神經(jīng)酰胺合成相關(guān)酶，SPT(SPTLC1，SPTLC2)，Cers(Cers1，Cers2，Cers3，Cers5，Cers6)，

7、以及神經(jīng)酰胺的代謝相關(guān)酶Cerk，Smpd1-3，Sgsm1，Asah，Gba，Sms。
　　4，采用Western Blot法檢測(cè)維生素D(200，100，50，25，12.5，0 nM)處理的PC12細(xì)胞中SPTLC1和Cers6的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1，隨神經(jīng)酰胺(C2-Cer)刺激濃度增加PC12細(xì)胞的存活率逐漸下降，并表現(xiàn)出劑量依賴性(P***＜0.05）。
　　2，在50nM維生素D刺激后

8、的PC12的中C16∶0-Cer的含量顯著低0nM維生素D刺激后的PC12細(xì)胞(P*＜0.05)。說(shuō)明維生素D具有降低C16∶0-Cer的含量的作用。
　　3，在50nM維生素D刺激后的PC12細(xì)胞中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(SPTLC1)的mRNA表達(dá)水平顯著高于0nM維生素D刺激后的PC12細(xì)胞（P***＜0.05）。CerS6的mRNA表達(dá)水平同樣顯著高于0nM維生素D刺激的PC12細(xì)胞（P***＜0.05）。
　　4，在

9、維生素D刺激后的PC12細(xì)胞中SPTLC1的蛋白表達(dá)隨著維生素D濃度的升高顯著降低，當(dāng)維生素D濃度為50nM時(shí)SPTLC1的相對(duì)蛋白表達(dá)量達(dá)到最低水平（P***＜0.05）。而Cers6的蛋白表達(dá)水平顯著升高，當(dāng)維生素D濃度為200nM時(shí)Cers6的相對(duì)蛋白表達(dá)量達(dá)到最高（P***＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　維生素D可能通過(guò)降低神經(jīng)酰胺的從頭合成的限速酶SPTLC1的蛋白表達(dá)水平來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)C16∶0-Cer的含量，從而

10、降低神經(jīng)酰胺對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。因此，我們推測(cè)，在MS中，維生素D也可能通過(guò)降低神經(jīng)酰胺的促神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，起到緩解MS的效果，為維生素D治療MS的機(jī)制研究提供了新思路。
　　二，基于iTRAQ技術(shù)篩選補(bǔ)充維生素D前后EAE大鼠血清中的差異蛋白
　　相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)是一種基于等重同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展迅速的定量蛋白質(zhì)組學(xué)高通量篩選技術(shù)。
　　目的:
　　應(yīng)

11、用iTRAQ技術(shù)，篩選誘導(dǎo)EAE前后及補(bǔ)充維生素D與未補(bǔ)充維生素D的EAE大鼠血清中表達(dá)差異的蛋白，篩選與EAE發(fā)病相關(guān)的血清標(biāo)志物，同時(shí)，為維生素D治療MS/EAE機(jī)制提供新思路。
　　方法:
　　制備EAE大鼠模型，并收集血清。采用iTRAQ技術(shù)對(duì)正常（C組），EAE發(fā)病組(EAE)和補(bǔ)充維生素D的EAE發(fā)病組(VE)大鼠血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
　　1，構(gòu)建EAE大鼠模型和補(bǔ)充維生素D:取18只大鼠平均分為三組，

12、正常組（C組，6只），發(fā)病組（EAE組，6只），補(bǔ)充維生素D發(fā)病組（VE組，6只）。誘導(dǎo)EAE大鼠模型，應(yīng)用等體積完全弗氏佐劑（CFA，含5mg/ml的百日咳疫苗）和堿性髓鞘蛋白溶液(MBP,1 mg/ml)混合液注射Lewis大鼠雙側(cè)足墊，自免疫之日起，記錄大鼠體重及評(píng)分情況。免疫發(fā)病后，處死大鼠，取大鼠心臟全血，離心取血清。
　　2，iTRAQ篩選EAE誘導(dǎo)前后及維生素D補(bǔ)充前后大鼠血清中差異表達(dá)的蛋白:每組中每三只大鼠血清混

13、合為一個(gè)樣品池，去除血清中高豐度蛋白后定量，酶解獲得肽段。利用同位素標(biāo)記肽段，SCX分級(jí)隨后進(jìn)行梯度Q-exactive分析，共計(jì)15次LC-MS/MS分析。得到原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)后通過(guò)Proteome Discoverer分析軟件檢索數(shù)據(jù)庫(kù)獲得差異表達(dá)蛋白。
　　3，篩選C組與E組大鼠血清中表達(dá)差異的蛋白及VE組與E組大鼠血清中表達(dá)差異的蛋白。
　　4，通過(guò)GO功能注釋和KEGG通路分析等生物信息學(xué)方法分析差異蛋白的功能屬性及作

14、用通路。
　　結(jié)果:
　　1，成功構(gòu)建EAE大鼠模型。
　　2，按照P-value小于0.05且表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍的標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)的蛋白。E組與C組相比，篩選出74種具有差異表達(dá)的蛋白，其中上調(diào)的蛋白42種，下調(diào)的蛋白32種;VE組與E組相比，篩選出80種差異表達(dá)的蛋白，其中上調(diào)蛋白40種，下調(diào)蛋白40種。其中E/C和VE/E中表達(dá)均變化的蛋白有20種。
　　3，生物信息學(xué)分析表達(dá)差異蛋白的功能及作用通

15、路。
　　4，選擇Proterin S100-A8和Interleukin1 receptor antagonist作為候選蛋白。它們不僅與EAE的發(fā)病相關(guān)而且能在維生素D的作用時(shí)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)首次將定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于EAE鼠血清中篩選差異表達(dá)的蛋白。我們篩選出了74種在EAE鼠與正常鼠血清中的表達(dá)差異的蛋白，為EAE發(fā)病機(jī)制的研究提供了精確定量組學(xué)數(shù)據(jù);我們還篩選出了80種補(bǔ)充VD的EAE大鼠與