α-突觸核蛋白和氧化應(yīng)激在PC12細(xì)胞中關(guān)系研究.pdf

1、背景：帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是一種常見(jiàn)的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，平均發(fā)病年齡為55 歲，70歲人群發(fā)病率達(dá)120/1萬(wàn)。PD的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前研究顯示其主要病理標(biāo)志為選擇性黑質(zhì)多巴胺(DA)神經(jīng)元缺失，殘存神經(jīng)元呈現(xiàn)a-突觸核蛋白(α-synucelin, AS)和泛素染色陽(yáng)性的胞漿內(nèi)包涵體( Lewy Body, LB)形成,黑質(zhì)-紋狀體通路DA 釋放減少，患者出現(xiàn)靜止性震顫，肌張力增

2、高，運(yùn)動(dòng)減少、隨意運(yùn)動(dòng)缺失、木僵等一系列癥狀。Α-突觸核蛋白（α-synuclein, SNCA）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的PD 致病基因。Synuclein 是分布于腦內(nèi)突觸前末梢的一組蛋白，被命名為α-synuclein,β-synuclein 和γ-synuclein。它們由113-143 個(gè)氨基酸殘基組成，參與DA 的神經(jīng)傳遞過(guò)程和突觸內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在這些蛋白中，α-synuclein 與PD 的發(fā)病有關(guān)。從幾個(gè)PD 大家系的研究中發(fā)

3、現(xiàn)，患者的染色體臂的4q21-23 攜有α-synuclein 突變位點(diǎn)，并呈染色體顯性遺傳。神經(jīng)變性疾病的病因、臨床表現(xiàn)各不相同，但都具有隨年齡增長(zhǎng)（中年以后）逐漸發(fā)生并進(jìn)展的特征。神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制中，毒性蛋白的錯(cuò)誤折疊和異常聚集是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)如α-synuclein,SNCA 基因突變（A53T）更容易形成聚集，導(dǎo)致家族性早發(fā)PD。研究顯示，SNCA 突變或過(guò)度表達(dá)可加速線粒體功能障礙、增強(qiáng)對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性以及DAT 介導(dǎo)

4、的毒性促進(jìn)細(xì)胞死亡。Α-synuclein 是Lewy 小體形成的聚集蛋白。Lewy 小體不僅存在于PD 患者腦內(nèi)，還存在于多種神經(jīng)退行性病的神經(jīng)組織中。
　　 目的：開(kāi)展對(duì)α-synuclein 所介導(dǎo)Lewy 小體病的病理機(jī)制研究，以及氧化應(yīng)激與α-synuclein 之間的關(guān)系，對(duì)認(rèn)識(shí)和診斷這類疾病具有重要的意義。
　　 方法：①構(gòu)建及鑒定人野生型及突變型SNCA 基因慢病毒表達(dá)載體，并觀察在體外大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞

5、中的表達(dá)。在引物合成后采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因，并將基因克隆到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU(含 GFP 基因)中，構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP，通過(guò)酶切、測(cè)序驗(yàn)證后，將pGC-FU-SNCA-GFP、pGC-FU-SNCAmu-GFP 質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0 共同轉(zhuǎn)染大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12 細(xì)胞， 并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。通過(guò)噻唑蘭比色法（

6、 MTT 法） 檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡水平， 慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP(OE)和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實(shí)驗(yàn)組)(Oem)及不加病毒的空白對(duì)照組（CON）和pGC-FU-GFP 空載體對(duì)照組（NC）共四組細(xì)胞, 病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）細(xì)胞增殖情況；碘化丙錠單染法（PI 單染法）檢測(cè)細(xì)胞周期，CON 組、NC 組、OE 組和Oem 組共四組細(xì)胞，檢測(cè)G1 期、G2 期和M期細(xì)胞

7、百分比。②利用已建立好的OE 型和Oem 型細(xì)胞，測(cè)定未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、野生型（WT）及突變型（A53T）α-synuclein 的PC12 細(xì)胞的活性氧（ROS）水平，以實(shí)時(shí)定量PCR 法和Western blot 法檢測(cè)分析經(jīng)0、50、100 和250 nmol/LH2O2 處理的OE 型和Oem 型細(xì)胞α-synuclein 表達(dá)。以細(xì)胞免疫熒光法和Westernblot 法檢測(cè)分析經(jīng)0、50、100 和250 nmol/L H

8、2O2處理的OE 型和Oem 型細(xì)胞Lamp-2和LC-3 蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴通過(guò)檢測(cè)標(biāo)簽蛋白綠色熒光蛋白(GFP)和目的蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCA-GFP 在靶細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)MTT 法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡水平，慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實(shí)驗(yàn)組)及不加病毒的空白對(duì)照組和pGC-FU-GFP 空載體對(duì)照組共四組細(xì)胞,

9、病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）細(xì)胞增殖F 值和P 值分別為4.534 和0.02；196.285 和0.00；411.829 和0.00；1282.049 和0.00；3135.559 和0.00，細(xì)胞增殖變緩。PI 單染法檢測(cè)細(xì)胞周期，與空載體組相比，pGC-FU-SNCA-GFP 組和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實(shí)驗(yàn)組)組G1 期細(xì)胞百分比均增多（P=0.00；P=0.00），pGC-FU-SN

10、CAmu-GFP 組較pGC-FU-SNCA-GFP 組G1 期細(xì)胞百分比增多更明顯（P=0.00）。⑵α-synuclein 轉(zhuǎn)染PC12 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增加，按未轉(zhuǎn)染的PC12 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的PC12 細(xì)胞、WT 型PC12 細(xì)胞、A53T 型 PC12細(xì)胞順序ROS 水平依次增加（P<0.05）；經(jīng)不同濃度H2O2 處理后，OE 型和Oem 型細(xì)胞α-synuclein mRNA 表達(dá)水平均無(wú)明顯改變，OE 型細(xì)胞

11、不同濃度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P> 0.05），Oem 型細(xì)胞不同濃度組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P> 0.05）；在Western blot 檢測(cè)中，隨著H2O2 濃度增加，α-synuclein 表達(dá)在OE 型細(xì)胞中減少，在Oem 型細(xì)胞中增加（均P<0.05）。H2O2處理后，LC3 蛋白的表達(dá)在OE型細(xì)胞中表達(dá)減少，但在Oem 型細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)；在Oem 型細(xì)胞中，Lamp-2 蛋白的表達(dá)在H2O2 處理后減少，而在OE 型細(xì)胞表達(dá)增加。