精原干細胞(SSCs)的建系及蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、近年來，不孕不育已成為日益嚴重的社會問題。其中，由于男性因素導(dǎo)致的不育約占到不孕不育總數(shù)的一半。2010年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎頒給英國科學(xué)家羅伯特·愛德華茲(Robert Edwards)，以表彰其在輔助生殖技術(shù)，特別是體外人工受精(In vitro fertilization，IVF)療法上的卓越貢獻。目前，全球超過10％的不育癥夫婦通過輔助生殖技術(shù)得到健康的子女。但是，由于技術(shù)的限制，包括IVF，卵胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytop

2、lasmic sperm injection，ICSI)在內(nèi)的輔助生殖技術(shù)都要求夫妻雙方提供成熟且健康的配子。因此對于無精子癥導(dǎo)致的男性不育患者，由于沒有成熟的雄性配子，不能接受輔助生殖的治療，目前唯一的解決方式是借助精子庫的精子受精，因而不能夠得到生物學(xué)意義上的子代。而在無精子癥患者中，真正的唯支持細胞綜合征患者只占到17％，大多數(shù)患者睪丸中仍存在正常的精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)。SSC

3、s是睪丸中維持雄性哺乳動物精子發(fā)生的成體干細胞，它一方面具有自我更新的能力，另一方面又可以分化出可以進行減數(shù)分裂的生殖細胞，最終形成雄性配子。因此SSCs具有臨床治療無精癥的潛在價值。在基礎(chǔ)研究中，SSCs不但可以作為研究干細胞增殖分化研究的平臺。更重要的是，SSCs在基因編輯，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠上，有著不可替代的優(yōu)勢。由于SSCs所分化出的單倍體雄性配子是遺傳物質(zhì)的直接攜帶者，因此在SSCs上進行轉(zhuǎn)基因操作再結(jié)合生殖細胞移植技術(shù)可以非常便

4、利的得到帶有轉(zhuǎn)基因的雄性配子，進而方便的得到轉(zhuǎn)基因動物。同時，在對于雄性生殖細胞基因功能的研究中，利用SSCs進行基因敲除，不但可以在體外培養(yǎng)時直接觀察所研究的基因?qū)τ赟SCs增殖及自我更新的影響，更重要的是，通過SSCs的移植實驗，可以直接觀察基因敲除的SSCs在遷移及后續(xù)分化，包括精母細胞減數(shù)分裂及精子變形中的表型，比傳統(tǒng)的構(gòu)建基因敲除模型后觀察其睪丸中的表型有非常大的便利。本研究分為三個部分：
　　第一部分：我們在體外建立了

5、三株小鼠SSCs細胞系。這些細胞系均可以在體外長期傳代培養(yǎng)，仍維持增殖的能力?；虮磉_分析結(jié)果顯示SSCs細胞系與體內(nèi)SSCs基因表達模式相同。將體外培養(yǎng)的SSCs移植到小鼠睪丸的曲細精管中，SSCs能夠在受體小鼠睪丸中定居，增殖，并進行了正常的精子發(fā)生過程。將移植了SSCs的受體鼠與野生型母鼠交配或進行ICSI后，都可以得到正常出生的，帶有與SSCs相同的轉(zhuǎn)基因標記的子代動物，證實這些經(jīng)過體外多代培養(yǎng)的SSCs具有良好的發(fā)育潛能。

6、r>　　第二部分：針對SSCs在單倍體生成及轉(zhuǎn)基因操作中的應(yīng)用，本文進行了一些嘗試。傳統(tǒng)方法中，要將在體外傳代培養(yǎng)的SSCs進一步分化成單倍體的精子，需要將其移植到受體小鼠曲細精管的微環(huán)境中。而在人類，將體外培養(yǎng)的細胞移植回病人的睪丸存在著安全隱患。同時對于那些睪丸微環(huán)境破壞或者睪丸內(nèi)體細胞不能支持生精的病人來說，SSCs睪丸移植不能解決這些問題。因此，其他的使SSCs進行精子分化的方法迫切需要被開發(fā)出來。SSCs在體內(nèi)所處的微環(huán)境需要

7、睪丸內(nèi)各種體細胞參與構(gòu)建，因此我們利用SSCs和新生小鼠睪丸體細胞在體外聚合，之后移植到受體小鼠的腎包膜下。移植后兩周可形成完整的生精上皮結(jié)構(gòu)，并在重構(gòu)的曲細精管中分選到單倍體細胞。我們利用單倍體的圓形精子細胞進行ICSI之后，得到了健康出生的子代小鼠。這些結(jié)果說明我們利用睪丸體細胞與在體外長期傳代培養(yǎng)的SSCs在異位重建了曲細精管的微環(huán)境，并維持了正常的精子發(fā)生過程，為在體外實現(xiàn)減數(shù)分裂得到配子打下了基礎(chǔ)。而在基因編輯方面，由于SSC

8、s在體外培養(yǎng)時增殖周期長，易于分化且不易接受外源基因整合等特點，對其進行基因編輯十分困難，成功率也非常低。我們嘗試使用最新的CRISPR Cas9基因打靶技術(shù)，對SSCs上進行基因編輯。結(jié)果證實，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，我們成功并高效的敲除了帶有GFP標記的SSCs中的GFP序列，使SSCs熒光消失。此工作證明，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以對SSCs進行定點的基因打靶，且可以獲得較高的效率。
　　第三部分：雖然部分參

9、與SSCs增殖及分化調(diào)節(jié)的信號通路被揭示出來，但是由特異表達蛋白組成的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對SSCs增殖與分化的調(diào)控機制仍知之甚少。為了深入了解SSCs中的蛋白質(zhì)表達情況，從整體水平揭示這些蛋白可能參與的生物學(xué)事件，并尋找出SSCs自我更新及分化所依賴的新蛋白分子，我們對已建立的SSCs細胞系進行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定到一些新的SSCs特異的表面分子，可以用于SSCs的分離和富集，同時鑒定出新的SSCs特異表達蛋白并分析了其可能參與的信號通路